一种基于绿光辐射量子点的单色ecl免疫检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种电致化学发光(electrogeneratedchemiluminescence, ECL)免疫检测方法，尤其涉及一种以能在绿光区域产生单色电致化学发光辐射的表面高度钝化CdSe量子点为标记物的免疫检测方法。
【背景技术】
[0002]目前绝大多数ECL试剂盒和临床诊断技术多采用Ru(bpy) 32+作为ECL标记物。鉴于Ru(bpy)32+体系的ECL辐射光谱较宽，且位于红光区域，在非红光区域开发高效的单色ECL体系对于ECL分析的基础和应用研宄都具有十分重要的价值。
[0003]量子点作为一类新型的ECL发光体，其独特的光电性质为非红光区域ECL体系的开发提供了可能。Liang等人采用近红外CdTe量子点开发了一种近红外的ECL免疫检测方法，并通过夹心免疫反应制得ECL免疫传感器检测甲胎蛋白(参见:Anal.Chem.2012,84,10645-10649)。中国专利文件 CN103048314A(申请号:201210439347.7)公开了一种负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电化学发光免疫传感器及对HIV的检测方法，基于负载量子点包被纳米金介孔材料构建的电致化学发光免疫传感器，实现对HIV抗体检测的夹心免疫分析方法；所述的电致化学发光免疫传感器是通过负载量子点并且包被纳米金的介孔材料作为信号标签，通过生物免疫的方法形成免疫复合物，修饰到电极表面，构成电致化学发光免疫传感器。
[0004]上述以量子点为标记物的ECL免疫检测方法虽然具有较高的灵敏度和准确性，但采用的量子点大都是ECL辐射在700nm附近的近红外量子点，仍属红光区域，检测范围仍然无法延伸至绿光区域。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明以CdSe量子点为标记物，提供了一种能在绿光区域产生单色辐射的ECL免疫检测方法，所构建的ECL检测方法具有ECL辐射强、光谱单色性好、灵敏度高、选择性好的特点。
[0006]术语说明:
[0007]巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点:可根据中国专利文件CN102766463A描述的方法得到。
[0008]抗原(Ag):本发明所述的抗原指:甲胎蛋白抗原，癌胚抗原，糖类抗原125，糖类抗原15-3，糖类抗原72-4，糖类抗原19-9，前列腺特异性抗原，游离前列腺特异抗原，爱滋病抗原，乙肝表面抗原，乙肝e抗原，甲状腺球蛋白，肌钙蛋白T抗原，肌红蛋白抗原等常规的抗原。
[0009]一抗(Ab1):本发明所述的一抗指:对上述抗原对应产生的抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
[0010]二抗(Ab2):本发明所述的二抗指:对上述抗原和一抗对应产生的二抗。
[0011]处理过的病人血清样品:指按照医学领域通用的血清处理标准处理后的病人血清样品。
[0012]本发明的技术方案如下:
[0013]一种基于绿光辐射量子点的单色ECL免疫检测方法，包括步骤如下:
[0014](I)CdSe量子点标记二抗(CdSe QDs-Ab2)的制备
[0015]向巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液中加入含有1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的缓冲溶液进行活化，离心纯化并分散在磷酸盐缓冲溶液中；然后加入二抗和小牛血清白蛋白，室温孵育l_2h后离心纯化，所得沉淀物分散在磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，得CdSe量子点标记的二抗(CdSeQDs-Ab2)；
[0016](2)以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器的制备
[0017]a、将玻碳电极抛光处理后，置于含对氨基苯甲酸(ABA)的磷酸盐缓冲溶液中，在
0.4?1.2V的电位范围内进行循环伏安扫描，制得对氨基苯甲酸(ABA)修饰的玻碳电极，再用含有1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的缓冲溶液进行活化，得修饰并活化后的玻碳电极；
[0018]b、向修饰并活化后的玻碳电极表面滴加含一抗(Ab1)的缓冲溶液，室温下孵育l_4h后用pH 7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液清洗，再用小牛血清蛋白(BSA)封闭未反应的活性位点并用磷酸盐(PBS)缓冲溶液清洗；
[0019]C、将抗原(Ag)滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育l_4h，清洗电极；再将CdSe量子点标记的二抗(CdSe QDs-Ab2)滴加到步骤b处理后的电极表面，室温下孵育l_4h，清洗电极；制得以CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器；
[0020](3)绘制工作曲线，进行单色ECL免疫检测
[0021]1、以步骤(2)制得的CdSe量子点为标记物的单色ECL免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极，在含0.01-0.lmol/L过硫酸铵的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，采用循环伏安法对一系列标准浓度的抗原溶液进行ECL测试，绘制工作曲线；
[0022]i1、将待测样品溶液按照步骤i中的方法进行ECL测试，根据所得电化学发光的光信号强度对应工作曲线，得到待测样品溶液中抗原的浓度。
[0023]根据本发明，优选的，步骤(I)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的荧光辐射范围为540nm-560nm，更优选550nm ；
[0024]优选的，所述的小牛血清白蛋白的体积分数为1_5%。
[0025]根据本发明，优选的，步骤(2)的b中，所述的小牛血清白蛋白的体积分数为
1-3% ；
[0026]优选的，步骤(2)的c中，所述的抗原为甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原125、糖类抗原15-3、糖类抗原72-4、糖类抗原19-9、前列腺特异性抗原、游离前列腺特异抗原、爱滋病抗原、乙肝表面抗原、乙肝e抗原、甲状腺球蛋白、肌钙蛋白T抗原或肌红蛋白抗原。
[0027]根据本发明，优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tris?HCl缓冲溶液或B?R缓冲溶液中的一种；所述的磷酸盐缓冲溶液为K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液。
[0028]根据本发明，优选的，步骤(I)中所述的巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液按如下方法制备得到:
[0029]室温下，搅拌条件下，向0.1-0.3mol/L CdCl2溶液中依次加入六偏磷酸钠(HMP)和巯基丙酸(MPA)，用NaOH调节溶液pH至8.0，加入Na2SeO3,加热回流5_15min后，加入N2H4.H2O,加热回流反应8-12h，即得巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的CdSe量子点的水溶液；
[0030]制备过程中Cd:MPA:HMP:Se -N2H4.H2O 的摩尔比为 1: (0.05-0.2): (0.3-0.7):(2-3):400o
[0031]本发明的原理:
[0032]本发明采用巯基丙酸和六偏磷酸钠包被的荧光辐射在540nm-560nm的CdSe量子点为标记物，该量子点表面被高度钝化，ECL光谱与其PL光谱的峰位置一致，且单色性良好。该量子点与生物分子反应后，其ECL光谱与其荧光光谱峰位置不变，且对其ECL发光强度影响较小。
[0033]本发明采用的CdSe量子点表面带有羧基，采用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化量子点表面的羧基后，与二抗的氨基反应，将量子点标记到二抗上，采用小牛血清蛋白(BSA)对量子点表面未反应的活性位点进行封闭。
[0034]本发明通过电聚合的方法使玻碳电极(GCE)与对氨基苯甲酸(ABA)形成碳氮键将ABA修饰在GCE上，得到表面具有羧基修饰的玻碳电极，与一抗中氨基反应得到表面有一抗修饰的玻碳电极，通过抗原抗体的特异性结合将抗原和量子点修饰的二抗修饰到电极表面。
[0035]本发明采用过硫酸铵为ECL的共反应剂，其发光过程如下:
[0036]R+e — R
[0037]S2O82 +e 一 SO4 +SO42