定量检测25-羟基维生素d的免疫层析试剂条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试剂条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]维生素D为类固醇衍生物，属脂溶性维生素。人体中的维生素D仅有小部分来源于食物，体内所需的维生素D的95%来源于阳光中紫外线照射皮肤产生。维生素D经血液循环进入肝脏，在25-羟化酶作用下转化为25-羟基维生素D，然后在肾近端小管上皮细胞线粒体内α羟化酶系统的作用下转变为1，25-二羟基维生素D，它是维生素D最大的生物作用形式，可以促进肠道钙结合蛋白的合成。而25-羟维生素D是代谢中的主要循环形式，能反映机体的维生素D储存水平并与维生素D缺乏的临床症状相关联，因此25-羟基维生素D是衡量维生素D体内水平的最可靠的临床指标。
[0003]维生素D的主要作是调节钙、磷代谢，靠促进钙和磷在肠道内的吸收，以及肾小管重吸收钙磷的方式，来提高血液中的钙磷水平，并用钙化的方法，与甲状旁腺激素和降钙素以及其他激素共同作用，使骨质变得坚硬。除了具有传统意义上的骨骼效应，还具有影响自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、肿瘤等非骨骼效应。研宄发现，维生素D缺乏会直接影响人类基因的表达，这些基因与风湿性关节炎和糖尿病等众多疾病有关。维生素D缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。研宄还表明维生素D缺乏可能使某些癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升高。
[0004]临床上对维生素D的定量检测已成为常规检测项目和体检项目。建立一种快速，简便，灵敏，准确可靠的检测维生素D水平的方法尤为重要。目前25-羟维生素D的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、液相色谱-质谱检测法以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题；液相色谱质谱操作复杂，用时较长；而化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。
【发明内容】
[0005]本发明为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试剂条及其制备方法，具有采样容易、操作简便、敏感度高、特异性强、稳定性好等优点，适合在基层医院、诊所以及体检中心等单位使用，对于降低维生素D检测成本、普及人体维生素D检测、减少临床盲目用药具有重要意义。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
一种定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条，包括依次设置的加样区、结合物释放区、反应区和吸水区；所述结合物释放区为包被胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的玻璃纤维素膜；所述反应区为测试区和控制区，测试区包被25羟基维生素D-偶联蛋白，控制区包被羊抗鼠IgG抗体的硝酸纤维素膜。
[0007]所述胶体金、量子点、上转换发光材料都是作为免疫层析技术中的标记物，间接读出待测物的浓度。
[0008]胶体金已发展成为免疫层析技术中最常用到的标记物。但是其主要进行定性或半定量检测，限制了它的应用范围。
[0009]胶体金的定量免疫层析技术的原理:胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。
[0010]量子点是一种半导体纳米晶，它激发光谱宽，呈连续分布，而发射光谱窄，单色性好且颜色可调，发光强度是传统有机荧光素的20~50倍，并且具有持久的光化学稳定性，其独特的光学性质使其作为一种新型的荧光探针而得到广泛关注。量子点作为标记物较之胶体金具有更高的灵敏度。
[0011]量子点缺点:制备条件苟1刻、反应步骤比较复杂、试剂成本高、毒性较大等。
[0012]上转换发光技术是免疫层析原理与光电转换原理相结合的免疫检测技术，以上转换发光颗粒作为示踪物，经过红外光激发后上传发光颗粒发射可见光，实现能量的上转，通过对光学信号的转换，能够快速对待测物进行定量检测。
[0013]上转换发光材料的优点:可以有效降低光致电离作用引起基质材料的衰退；不需要严格的相位匹配，对激发波长的稳定性要求不高；输出波长具有一定的可调协性。
[0014]上转换发光材料的缺点:反应时间较长；标准曲线范围相对较窄；发光效率较低，稳定性较差。
[0015]本发明所述定量检测25-羟基维生素D的免疫层析试纸条将包被有胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体的结合物释放区与包被有25-羟基维生素D-偶联蛋白的测试区连在一起，利用胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)免疫层析法竞争性结合单抗原理，即被检测者血清的25-羟基维生素与包被在硝酸纤维素膜上的25-羟基维生素D-偶联蛋白竞争性结合25-羟基维生素D单克隆抗体的原理，通过检测测试区的颜色深浅(或被激发的量子点的荧光强度或被激发的UCP颗粒的发光强度)，定量检测人血清中的25-羟基维生素D。
[0016]当血清中不存在25-羟基维生素D时，胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体由于毛细管作用沿着结合物释放区移动至测试区，与该测试区包被在硝酸纤维素膜上的25-羟基维生素D结合，从而在测试区出现一条紫红色条带(或经激发后产生强的荧光信号或经激发后产生强的发射光)；当血清中存在25-羟基维生素D时，胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体首先与血清中的25-羟基维生素D结合形成复合物，然后受毛细管作用沿着结合物释放区移动至测试区，但没有或仅有少量的胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体与测试区的25-羟基维生素D-偶联蛋白结合，测试区线颜色消失或变浅(或经激发后只能产生弱的荧光信号或经激发后只能产生弱的发射光)，在一定条件下，测试区线颜色的深浅(或荧光的强度或发射光的强度)和样品中的浓度呈负相关，采用相应的免疫层析仪可定量判断人血清中的25-羟基维生素D浓度。
[0017]而控制区包被羊抗鼠IgG抗体，胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体与包被的羊抗鼠IgG抗体结合，从而在控制区出现一条紫红色条带(或经激发后产生强的荧光信号或经激发后产生强的发射光)，可判断试纸条及检测结果是否有效，也作为测定试剂的内控标准。如果控制区没有产生紫红色条带(或经激发后没有产生强的荧光信号或经激发后没有产生强的发射光)，则说明试纸条失效。
[0018]进一步的，本发明所述25-羟基维生素D检测试纸条还包括PVC背衬板，所述加样区、结合物释放区、反应区、吸水区依次相互搭接的粘贴在PVC背衬板上。
[0019]由于25-羟基维生素D的浓度最终由胶体金的颜色深浅(或量子点经激发后产生的荧光强度或上转换发光材料UCP经激发后产生的发射光强度)来决定，因此25-羟基维生素D单克隆抗体扮演了连接胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)和25-羟基维生素D这两种物质的重要角色，既能与胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)结合，又能与25-羟基维生素D结合，其中25-羟基维生素D单克隆抗体与25-羟基维生素D结合是一个自发的过程，而25-羟基维生素D单克隆抗体与胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的结合需要人为的促进。生产的一个重要步骤就是胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)
25-羟基维生素D单克隆抗体。
[0020]其中，作为优选，本发明所述胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的25-羟基维生素D单克隆抗体的制备方法为向ImL pH7.4，50mM的磷酸盐缓冲液中加入2 μ mol胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)和Img鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体，室温下温和振荡2小时，然后12000r/min离心30min，取沉淀即得。
[0021]所述25羟基维生素D-偶联蛋白的制备方法包括以下步骤:
将1mg维生素D溶解于100 μ L有机溶剂中，然后在搅拌条件下向10mL，浓度为5mg/mL的偶联蛋白溶液中逐滴加入溶解后的维生素D，再逐滴加入体积百分比浓度为50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的体积百分比浓度为I %?3%，搅拌5min?20min后移至4°C下搅拌反应16h?18h，反应后的反应液用PBS缓冲溶液在4°C下透析8h，透析过程中换液2?3次，透析物离心后取上清液，最后将上清液用0.45 μm滤膜过滤，得到维生素D与偶联蛋白的偶联物，即25羟基维生素D-偶联蛋白，_20°C保存备用。
[0022]其中，所述有机溶剂为三氯甲烷、甲醇、乙醇、正己烷、乙腈、二甲基亚砜、1，4_ 二氧六环中的一种。
[0023]其中，所述偶联蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)中的一种。
[0024]其中，所述鼠抗人25-羟基维生素D单克隆抗体、25-羟基维生素D和羊抗鼠IgG抗体是本领域技术人员公知的，可以通过商业途径获得或通过现有技术中公开的方法制备得到。
[0025]作为信号读取的胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)是试纸条定量检测中的重点。胶体金(或量子点或上转换发光材料UCP)的大小、均一度、稳定性都会影响产品的最后读数。作为优选，本发明所述25-羟基维生素D检测试纸