高空间分辨激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于共焦显微成像技术、光谱成像技术和质谱成像技术领域，将双轴差动共焦显微成像技术、质谱成像技术和光谱探测技术相结合，涉及一种高空间分辨激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，可用于生物质谱的高分辨成像。
技术背景
[0002]质谱仪(Mass Spectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。
[0003]自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域一生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研宄的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研宄提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。
[0004]但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题:
[0005]I)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；
[0006]2)无法对中性原子、分子、中离子及基团等进行探测，其结果制约了样品质谱成分的准确完整获取；
[0007]3)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移冋题。
[0008]而生物样品“微区”完整组分信息的准确获取对于生命科学研宄具有极其重要的意义。事实上，如何高灵敏地探测微区质谱信息是目前生物质谱领域亟待研宄的重要技术冋题。
[0009]实事上，强脉冲激光聚焦到样品表面会使样品离子化，可激发出带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子等。如何能够完整地获取带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子的信息，对于高精度分析样品的组分具有重要意义。
[0010]利用激光诱导击穿光谱(LIBS)技术可测量等离子体发射光谱信息，获得样品中元素成分。将激光诱导击穿光谱(LIBS)技术与质谱探测技术相结合，可用来弥补激光质谱成像技术中无法获得中性原子、分子和中离子信息的不足。
[0011 ] 激光共焦显微镜“点照明”和“点探测”的成像探测机制，不仅使其横向分辨力较同等参数的光学显微镜改善1.4倍，而且还使共焦显微镜极便于与超分辨光瞳滤波技术、径向偏振光紧聚焦技术等结合来压缩聚焦光斑，进一步实现高空间分辨显微成像。
[0012]基于此，本发明提出一种高空间分辨力的激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，其创新在于:首次将具有高空间分辨能力双轴差动共焦显微技术与激光诱导击穿光谱(LIBS)技术和质谱探测技术相融合，可实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。
[0013]本发明一种高空间分辨激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。
【发明内容】
[0014]本发明的目的是提高质谱成像的空间分辨能力、抑制成像过程中聚焦光斑相对样品的漂移，提出一种高空间分辨激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测样品成分空间信息和功能信息。本发明将激光双轴差动共焦显微镜聚焦光斑的探测功能与激光聚焦解吸电离功能相融合，利用经超分辨技术处理的双轴差动共焦显微镜的微小聚焦光斑对样品进行高空间分辨形态成像，利用质谱探测系统对双轴差动共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对双轴差动共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱信息进行光谱成像，然后再通过探测数据信息的融合与比对获得完成的样品成分信息，继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。
[0015]本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
[0016]本发明的一种高空间分辨激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像方法，其利用高空间分辨双轴差动共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行定焦与成像，利用质谱探测系统对双轴差动共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对双轴差动共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱进行探测，然后再通过探测数据信息的融合与比对分析继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的同时成像与探测，包括以下步骤:
[0017]步骤一、使平行光束通过环形光发生系统后整形为环形光束，该环形光束再经测量物镜聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽；
[0018]步骤二、使计算机控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向在测量物镜焦点附近上下移动，利用采集物镜、聚焦透镜、中继放大透镜和位于中继放大透镜焦面并关于采集光轴对称放置的第一光强点探测器和第二光强点探测器对放大艾里斑进行分割探测，得到艾里斑第一微区和艾里斑第二微区的强度特性曲线分别为第一离轴共焦轴向强度曲线和第二离轴共焦轴向强度曲线；
[0019]步骤三、将第一离轴共焦轴向强度曲线和第二离轴共焦轴向强度曲线相减处理得到双轴差动共焦轴向强度曲线；
[0020]步骤四、计算机依据双轴差动共焦轴向强度曲线的零点位置zA值控制三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向运动，使测量物镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上；
[0021]步骤五、利用电离样品吸管将聚焦光斑解吸电离被测样品产生的等离子体羽中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息;
[0022]步骤六、利用由三维工作台、采集物镜、聚焦透镜、中继放大透镜和位于中继放大透镜焦面并关于采集光轴对称放置的第一光强点探测器和第二光强点探测器构成的激光双轴差动共焦探测系统对测量物镜聚焦到被测样品的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；
[0023]步骤七、利用光谱探测系统对经分色器反射和光谱收集透镜收集的激光诱导击穿光谱进行探测，测得对应聚焦光斑区域的光谱信息；
[0024]步骤八、计算机将激光双轴差动共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息、光谱探测系统同时探测的激光聚焦微区的光谱信息、质谱探测系统同时测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态、光谱和质谱信息；
[0025]步骤九、计算机控制三维工作台使测量物镜焦点对准被测对象的下一个待测区域，然后按步骤二?步骤八进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态、光谱和质谱信息；
[0026]步骤十、重复步骤九直到被测样品上的所有待测点均被测到，然后利用计算机进行处理即可得到被测样品形态、光谱和质谱信息。
[0027]本发明高空间分辨激光双轴差动共焦光谱一质谱显微成像方法中，包括步骤一可为使平行光束通过矢量光束发生系统、光瞳滤波器后整形为环形光束，该环形光束再经测量物镜聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽。
[0028]本发明的一种高空间分辨激光双轴差动共焦光谱-质谱显微成像装置，包括点光源、沿光轴方向放置的准直透镜、产生环形光束的环形光发生系统和聚焦光斑到被测样品的测量物镜，包括沿采集光轴方向放置的用于探测测量物镜聚焦光斑反射光强度信号的采集物镜、聚焦透镜、中继放大透镜和位于中继放大透镜焦面并关于采集光轴对称放置的第一光强点探测器和第二光强点探测器，还包括探测激光诱导击穿光谱的分色镜、位于分色镜反射光方向的光谱收集透镜和位于光谱收集透镜焦点处的光谱探测系统，以及沿测量面法线方向、用于探测测量物镜聚焦光斑解析电离的离子体羽组分的电离样品吸管和质谱探测系统，入射光轴和采集光