高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于共焦显微成像技术、光谱成像技术和质谱成像技术领域，将激光差动共焦技术、光谱成像技术和质谱成像技术相结合，涉及一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，可用于生物质谱领域的高分辨成像。
技术背景
[0002]质谱仪(Mass Spectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。
[0003]自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域一生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研究的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研究提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。
[0004]但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题:
[0005]I)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；
[0006]2)无法对中性原子、分子、中离子及基团等进行探测，其结果制约了样品质谱成分的准确完整获取；
[0007]3)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移问题。
[0008]而生物样品“微区”完整组分信息的准确获取对于生命科学研究具有极其重要的意义。事实上，如何高灵敏地探测微区质谱信息是目前生物质谱领域亟待研究的重要技术问题。
[0009]实事上，强脉冲激光聚焦到样品表面会使样品离子化，可激发出带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中尚子等。如何能够完整地获取带电的原子、分子、分子碎片和中性的原子、分子、中离子的信息，对于高精度分析样品的组分具有重要意义。
[0010]利用激光诱导击穿光谱(LIBS)技术可测量等离子体发射光谱信息，获得样品中元素成分。将激光诱导击穿光谱(LIBS)技术与质谱探测技术相结合，可用来弥补激光质谱成像技术中无法获得中性原子、分子和中离子信息的不足。
[0011 ] 激光共焦显微镜“点照明”和“点探测”的成像探测机制，不仅使其横向分辨力较同等参数的光学显微镜改善1.4倍，而且还使共焦显微镜极便于与超分辨光瞳滤波技术、径向偏振光紧聚焦技术等结合来压缩聚焦光斑，进一步实现高空间分辨显微成像。
[0012]基于此，本发明提出一种高空间分辨力的激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，其创新在于:首次将具有高空间分辨能力的差动共焦显微技术与激光诱导击穿光谱(LIBS)技术和质谱探测技术相融合，可实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的成像与探测。
[0013]本发明一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。
【发明内容】
[0014]本发明的目的是为了提高质谱显微成像技术的空间分辨力、抑制成像过程中聚焦光斑相对样品的漂移，提出一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测样品成分空间信息和功能信息。
[0015]本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
[0016]本发明的一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法，其利用高空间分辨激光差动共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像，利用质谱探测系统对激光差动共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，利用光谱探测系统对激光差动共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的等离子体发射光谱进行探测，然后再通过探测数据信息的融合与比对分析继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形态与组分的同时成像与探测，其包括以下步骤:
[0017]步骤一、使平行光束通过环形光发生系统后整形为环形光束，该环形光束再经沿光输出方向依次经分光镜、中孔分色器反射进入中孔测量物镜并聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽；
[0018]步骤二、使计算机控制由中孔测量物镜、与中孔测量物镜同轴放置的轴向物镜扫描器、中孔分色器、分光镜和位于分光镜反射光方向的差动共焦光强探测器构成的激光差动共焦探测系统通过轴向物镜扫描器对被测样品进行轴向扫描测得第一共焦轴向强度曲线和第二共焦轴向强度曲线；
[0019]步骤三、将第二共焦轴向强度曲线和第一共焦轴向强度曲线差动相减得到差动共焦轴向强度曲线；
[0020]步骤四、计算机依据差动共焦轴向强度曲线的零点位置^值控制轴向物镜扫描器使中孔测量物镜7的聚焦光斑聚焦到被测样品上；
[0021]步骤五、利用电离样品吸管将聚焦光斑解吸电离被测样品产生的等离子体羽中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；
[0022]步骤六、利用由中孔测量物镜、轴向物镜扫描器、中孔分色器、分光镜和位于分光镜反射光方向的差动共焦光强探测器构成的激光差动共焦探测系统对中孔测量物镜聚焦到被测样品的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；
[0023]步骤七、利用光谱探测系统对经中孔分色器透射、中孔反射镜反射和光谱收集透镜收集的激光诱导击穿光谱进行探测，测得对应聚焦光斑区域的组分信息；
[0024]步骤八、计算机将激光差动共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息、光谱探测系统同时探测的激光聚焦微区的激光诱导击穿光谱、质谱探测系统同时探测的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态、光谱和质谱信息；
[0025]步骤九、计算机控制二维工作台使中孔测量物镜对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二?步骤八进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态、光谱和质谱信息；
[0026]步骤十、重复步骤九直到被测样品上的所有待测点均被测到，然后利用计算机10进行处理即可得到被测样品形态、光谱和质谱信息。
[0027]本发明的高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法中，包括步骤一可为使平行光束通过沿光轴方向放置的矢量光束发生系统、分光镜和光瞳滤波器后整形为环形光束，该环形光束再经中孔分色器反射进入中孔测量物镜并聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽。
[0028]本发明的高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像方法中，包括步骤九可为计算机控制二维扫描振镜系统使中孔测量物镜对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二?步骤八进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态、光谱和质谱信息。
[0029]本发明的一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像装置，包括激光点光源系统、沿光轴方向放置的准直透镜、产生环形光束的环形光发生系统、分光镜、中孔分色器和沿折转光轴方向放置的聚焦光斑到被测样品的中孔测量物镜，包括用于探测中孔测量物镜聚焦光斑反射光强度信号的差动共焦光强探测器以及用于探测中孔测量物镜聚焦光斑解析电离的离子体羽组分的电离样品吸管和质谱探测系统，还包括探测激光诱导击穿光谱的中孔分色器、中孔反射镜、位于中孔分色器透射光方向的中孔反射镜、位于中孔反射镜反射光方向的光谱收集透镜和光谱收集透镜焦点处的光谱探测系统。
[0030]本发明的一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像装置中，差动共焦强度探测器包括探测分光镜，依次放置在探测分光镜透射光方向的第一集光透镜、第一探测针孔、第一光强探测器，还包括依次放置在探测分光镜反射光方向的第二集光透镜、第二探测针孔和第二光强探测器，第一探测针孔置于第一集光透镜焦前，第二探测针孔置于第二集光透镜焦后，第一集光透镜与第二集光透镜焦距相等，第一探测针孔和第二探测针孔离焦量大小相同方向相反。
[0031]本发明的一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像装置中，包括环形光发生系统可用沿光轴方向放置的产生矢量光束的矢量光束发生系统和光瞳滤波器替代。
[0032]本发明的一种高空间分辨激光差动共焦光谱-质谱显微成像装置中，包括激光点光源系统可以由脉冲激光器、位于激光出射方向的聚焦透镜和位于聚焦透镜焦点的针孔构成。
[0033]有益效果
[0034]本发明对比已有技术，具有以下优点:
[0035]I)将具有高空间分辨能力的激光差动共焦显微技术与质谱探测技术相融合，使激光差动共焦显微成像系统的光斑实现聚焦探测和样品解析电离双重功能，可实现样品