用于抗微生物剂抗性测定的方法
【专利说明】用于抗微生物剂抗性测定的方法
[0001] 本申请是申请号为"201080028598. 5"，申请日为"2010年5月6日"，发明名称为 "用于抗微生物剂抗性测定的方法"的申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2009年5月7日提交的标题为"Methods for Antimicrobial Resistance Determination(用于抗微生物剂抗性测定的方法）"的美国临时专利申请第 61/215, 594号的权益，其在本文中并入。 发明领域
[0004] 本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法和系统。本发明还提供了用 于在单个系统内原位测定微生物的抗生素抗性状况的方法。
[0005] 发明背景
[0006] 血流感染伴有高发病率和高死亡率，然而目前的诊断方法：培养、随后生化鉴定和 抗生素敏感性检验，可需要数天来进行。通常，基于临床症状启动经验疗法，且检验结果仅 在起始疗法失败时影响临床决策。阳性血液培养结果之后1小时内鉴定血流感染的能力将 显著地提高所提供的诊断信息的临床相关性。已提出了分子扩增方法来满足该需求，但对 于该方法存在严重的挑战。阳性血液培养物肉汤本身代表具有用于多种快速鉴定（ID)检 验的可能性的微生物的天然扩增群体。
[0007] 甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (MRSA)是可以甚至在 健康患者中快速导致感染的危险的社区获得性和医院获得性病原体。其也常作为正常菌群 存在于大量年老的和患病的患者中，并在健康护理环境中具有快速交叉感染多个患者的能 力。"甲氧西林抗性"的机制基本上由称作PBP2a的改变的青霉素结合蛋白2的产生来介 导，其保留了功能性酶活性但对于β-内酰胺抗生素具有显著降低的亲和力。万古霉素抗 性肠球菌（enterococci) (VRE)是需要立即鉴定的另一组危险的病原体。以与甲氧西林抗 性相似的方式，万古霉素抗性也是由抗生素对其细胞膜靶标的降低的亲和力来介导。
[0008] 目前鉴定MRSA和VRE的方法是劳动强度大的且由于可能导致使用者的气溶胶暴 露的步骤而可能是不安全的。迫切需要快速且安全和可靠的方法以分离血液培养物肉汤中 所含的微生物，其适合快速测定抗性。本发明提供了这样的方法。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供了用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法。该方法允许比现有技术 更快地测定微生物的抗生素抗性状况，导致更快的诊断（例如，在患有或怀疑患有败血症 和/或其他感染的受试者中）和受污染物质（例如，食品、供水和药品）的表征。包括在本 发明方法中的步骤一一从获得样品至微生物的抗生素抗性状况的测定，可在非常短的时间 范围中进行以产生临床相关的可操作的信息，例如，在少于约240分钟之内。此外，本发明 的方法可以完全自动化，从而降低了操作传染性材料的风险和/或污染样品的风险。
[0011] 本发明的第一方面涉及测定微生物的抗生素抗性状况的方法，包括：
[0012] (a)在可形成微生物/抗性测定亲和配体复合物的条件下，将微生物与抗性测定 亲和配体相接触；
[0013] (b)将（a)中形成的微生物/抗性测定亲和配体复合物与未结合的抗性测定亲和 配体相分离；
[0014] (C)测定微生物/抗性测定亲和配体复合物中与微生物结合的抗性测定亲和配体 的量；和
[0015] (d)将微生物/抗性测定亲和配体复合物中与微生物结合的抗性测定亲和配体的 量与被同样的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或 抗生素抗性菌株的群体所结合的抗性测定亲和配体的量相比较；
[0016] 其中如果微生物/抗性测定亲和配体复合物中的微生物结合的抗性测定亲和配 体的量与被抗生素敏感性微生物结合的抗性测定亲和配体的量不同，或微生物/抗性测定 亲和配体复合物中的微生物结合的抗性测定亲和配体的量与被抗生素敏感性微生物结合 的抗性测定亲和配体的量相同，那么将该微生物鉴定为抗生素抗性的。
[0017] 在一些实施方案中，步骤（a)、（b)、（C)和/或（d)中的一个或多个可以在密封的 容器中进行。
[0018] 在一些实施方案中，所述抗性测定亲和配体可选自由以下组成的组：抗生素，单 克隆抗体和多克隆抗体及其片段，核酸探针，酶底物，适体，肽模拟物，噬菌体来源的结合蛋 白，凝集素，宿主防御肽，细菌素，噬菌体，对核酸、脂质、碳水化合物、多糖、蛋白选择性的染 料，和其组合。
[0019] 在一些实施方案中，所述抗性测定亲和配体可以是抗生素。
[0020] 在一些实施方案中，所述抗性测定亲和配体可以是β -内酰胺抗生素或糖肽抗生 素。
[0021] 在一些实施方案中，所述抗性测定亲和配体可包括可检测的标记物。优选地，所述 可检测的标记物可以是荧光的、发光的、发磷光的、放射性的、拉曼活性的、质谱反应性的和 /或比色的化合物标记物。
[0022] 在一些实施方案中，所述微生物可在临床或非临床样品中。优选地，所述样品可来 自阳性血液培养物。
[0023] 在一些实施方案中，可在分离步骤（b)之前对包括所述微生物的样品进行处理以 选择性地裂解可能存在于所述样品中的任何非微生物细胞。
[0024] 在一些实施方案中，所述微生物可被层叠在容器中的密度垫层上并且分离步骤 (b)可以是通过离心所述容器。优选地，所述密度垫层可包括以下物质的一种或多种的任何 组合：显微镜浸油、矿物油、硅油、氟硅油、硅凝胶、胶态二氧化硅、碘化造影剂、蔗糖、甲泛影 酸盐-Fieoir、泛影酸盐-葡聚糖、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚氧化乙烯（高分子 量）、Pluronick F127、piuroniick F68、聚丙條酸、交联的聚乙條醇、交联的聚乙條吡略烧、 PEG甲醚甲基丙烯酸醋、果胶、琼脂糖、黄原胶、吉兰糖、Phytagd?、山梨糖醇、Pieoiiie、甘 油、葡聚糖、糖原、氯化铯、全氟化碳液体、和/或氢氟碳液体。优选地，所述密度垫层可具有 约I. 025g/ml至约I. 120g/ml的密度。优选地，所述容器可包括在所述容器的底部、顶部和 /或一个或多个侧部的光学窗口，并且所述光学窗口可透过近红外光谱、紫外光谱和/或可 见光谱中的至少一部分。优选地，在该实施方案中，步骤（c)可包括回收所述微生物以产生 回收的微生物的步骤。
[0025] 在一些实施方案中，所述测定步骤（C)可包括光谱学。优选地，所述光谱学可选自 由以下组成的组：荧光光谱学、漫反射光谱学、吸收和透射光谱学、红外光谱学、太赫兹光谱 学、拉曼光谱学、表面增强拉曼光谱学、空间偏移拉曼光谱学、共振拉曼光谱学，和其任何组 合。优选地，所述光谱学可以是正面荧光光谱学。优选地，所述光谱学可包括测定激发-发 射矩阵（EEM)。更优选地，所述EEM可包括至少两种不同的波长。优选地，可将所述EEM与 已知微生物的EEM的数据库相比较。
[0026] 在一些实施方案中，所述结合的抗性测定亲和配体的量可在每个细胞基础上通过 将结合的量与所述微生物的内在性质相比较来测定。优选地，所述内在性质可以是内在荧 光。
[0027] 在一些实施方案中，步骤（d)可包括将所述结合的抗性测定亲和配体的量与被同 样的微生物的抗生素敏感性和抗生素抗性菌株二者所结合的抗性测定亲和配体的量相比 较。
[0028] 在一些实施方案中，被同样的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株所 结合的量可先前已被测定。
[0029] 在一些实施方案中，所述方法可以是至少部分自动化的。
[0030] 本发明的另一方面涉及一种用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法，所述方法 包括：
[0031] (a)在可形成微生物/抗性测定亲和配体复合物的条件下，将所述微生物与抗性 测定亲和配体相接触；
[0032] (b)将（a)中形成的微生物/抗性测定亲和配体复合物与未结合的抗性测定亲和 配体相分离；
[0033] (C)测定所述微生物/抗性测定亲和配体复合物中的所述抗性测定亲和配体对所 述微生物的结合亲和力；和
[0034] (d)将所述微生物/抗性测定亲和配体复合物中的所述抗性测定亲和配体对所述 微生物的结合亲和力与抗性测定亲和配体对同样的微生物的已知的抗生素敏感性或抗生 素抗性菌株或已知的抗生素敏感性或抗生素抗性菌株的群体的结合亲和力相比较；
[0035] 其中如果所述微生物/抗性测定亲和配体复合物中的所述微生物表现出的抗性 测定亲和配体的结合亲和力与所述抗生素敏感性微生物所表现出的结合亲和力不同，或所 述微生物/抗性测定亲和配体复合物中的所述微生物表现出的抗性测定亲和配体的结合 亲和力与所述抗生素抗性微生物所表现出的抗性测定亲和配体的结合亲和力相同，那么所 述微生物被鉴定为抗生素抗性的。
[0036] 在另一方面，本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的方法，包括：
[0037] (a)获得已知含有或可能含有微生物的检验样品；
[0038] (b)在可形成微生物/抗性测定亲和配体复合物的条件下将检验样品中的微生物 与抗性测定亲和配体相接触；
[0039] (C)任选地添加测量细胞新陈代谢或膜完整性的一种或多种荧光染料；
[0040] (d)任选地选择性地裂解可能存在于样品中的任何非微生物细胞以产生裂解的样 品；
[0041] (e)将微生物与所述检验样品或所述裂解的样品中的其他组分相分离，以形成微 生物的沉淀物（pellet);
[0042] (f)探测该沉淀物以产生微生物的测量结果；
[0043] (g)通过将该测量结果与针对同种的抗生素抗性和/或抗生素敏感性微生物所取 得的或预测的测量结果相比较而在所基于的检验样品中测定微生物的抗生素抗性状况。
[0044] 在一些实施方案中，在步骤（C)中添加了一种或多种荧光染料。优选地，所述微生 物可被层叠在容器中的密度垫层上，并且分离步骤（b)是通过离心所述容器。
[0045] 在一些实施方案中，步骤（g)中的所述抗生素抗性测定可被测定为诱导的抗性。
[0046] 在一些实施方案中，所述探测步骤（f)可包括通过光谱学进行的探测。优选地，所 述光谱学可选自由以下组成的组：荧光光谱学、漫反射光谱学、吸收和透射光谱学、红外光 谱学、太赫兹光谱学、拉曼光谱学、表面增强拉曼光谱学、空间偏移拉曼光谱学、共振拉曼光 谱学，和其任何组合。
[0047] 在一个实施方案中，分离步骤通过以下来进行：将微生物/抗性测定亲和配体复 合物层叠（layering)在容器（例如，气密密封的容器）中的密度垫层（density cushion) 上并离心该容器以沉淀该微生物/抗性测定亲和配体复合物，同时含有未结合的配体的培 养基保留在密度垫层的顶部。在另一个实施方案中，容器在底部和/或侧部具有光学窗口 从而可对微生物/抗性测定亲和配体复合物沉淀物进行分光镜探测以用于测定步骤。可通 过将沉淀物的光谱与已知抗生素抗性状况的微生物的一个或多个光谱相比较而测定微生 物的抗生素抗性状况。无需进一步操作而直接在沉淀物中和/或气密密封的容器中测定微 生物的抗生素抗性状况的能力增强了微生物鉴定的安全性。
[0048] 在一个实施方案中，测定步骤通过回收微生物/抗性测定亲和配体复合物沉淀 物、在适宜的培养基中重悬微生物和诸如利用分光镜方法探测该重悬的微生物来进行。在 另一个实施方案中，方法还包括对重悬的微生物进行进一步的鉴定和/或表征检验（例如， 药物抗性、毒力因子、抗菌谱）。
[0049] 在另一方面，本发明涉及用于测定微生物的抗生素抗性状况的系统，包括：
[0050] (a)容器，所述容器包括微生物或含有微生物的样品、和抗性测定亲和配体；
[0051] (b)密度垫层；和
[0052] (C)提供测量结果的分光计；
[0053] 其中所述测量结果测定已通过在所述系统内原位分离而在所述容器中浓缩的微 生物的抗生素抗性状况。在另一个实施方案中，系统包括用于将微生物与未结合的抗性测 定亲和配体相分离的离心机。
[0054] 本文的附图和以下所列的描述中更详细地解释了本发明。
[0055] 附图简述
[0056] 图1显示了用Bocillintm-Fl (BODiPY FL-标记的青霉素）进行的甲