一种特异性检测金黄色葡萄球菌的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于食品安全领域，具体涉及一种食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。
【背景技术】：
[0002] 金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的革兰氏阳性菌，广泛分布于自 然界，如空气、土壤、水及人和动物的排泄物中。该菌对生长环境不严格，为条件致病菌，而 大多食品基质如乳、肉、蛋、鱼等制品为金葡菌生长提供了良好条件，在适合的温度下，易产 生耐高温的肠毒素而引起食品中毒，伴有呕吐剧烈，失水及虚脱等症状。据统计，在世界各 国中由金葡菌引发的食物中毒在细菌性食物中毒中排在前三位，占约25%，并造成巨大的 经济损失，严重影响人类食品安全和经济发展。因而，建立快速有效吸附和检测金黄色葡萄 球菌的方法变得尤为重要。
[0003] 目前已建立的金黄色葡萄球菌检测方法主要包括Baird-Parker方法、酶联免疫 吸附法（ELISA)、聚合酶链式反应（PCR)等。现场快速筛检方法中则以ELISA方法应用最 多，该方法是基于抗原-抗体亲和反应，以抗体作为识别分子。但是抗体易受到外界条件尤 其是温度的影响，对保藏条件要求苛刻，在很大程度上限制了方法的灵活应用。此外，抗体 制备需要经过动物实验或细胞实验，繁琐费事，制备的抗体成本高，发展的方法检测成本也 相应偏高。所以又必要发展一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、使用成本低的新 型检测方法。
[0004] 最近，ATP生物发光检测细菌的方法已日渐成熟，其原理是基于每个生物体内含有 恒量的ATP，ATP在萤火虫荧光素和荧光素酶的催化下释放光子产生荧光，发光强度与生物 体量呈正比，从而间接检测出生物体的含量。尽管ATP生物发光法具有快速检测的特点，但 是不能分辨菌株种类。因此，有必要建立一种基于ATP生物发光法快速检测食品中金黄色 葡萄球菌单一致病菌的检测方法。
【发明内容】
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[0005] 本发明目的在于提供一种核酸适配体修饰磁性纳米粒子捕捉、富集金黄色葡萄球 菌，并采用生物发光检测的方法。本发明采用的技术方案为：将对金黄色葡萄球菌具有特异 性识别功能的核酸适配体修饰在磁性纳米粒子表面，该材料可以快速识别并结合溶液样品 中的金黄色葡萄球菌；利用磁场将磁性纳米颗粒结合的金黄色葡萄球菌分离；再将捕捉到 的金黄色葡萄球菌悬浮到一定体积的裂解液中，释放并用提取出金黄色葡萄球的ATP ;由 于ATP量与菌液浓度呈正比，通过ATP生物发光法得到细菌浓度与发光强度的线性曲线，即 可检测金黄色葡萄球菌。具体步骤为：
[0006] (I)Fe3O4磁性纳米粒子制备
[0007] 以FeCl3 · 6H20作为单一铁源，乙二醇为还原剂，醋酸钠提供碱性的反应环境，在 密闭的高温高压环境下，Fe3+可被乙二醇部分还原为Fe 2+，铁离子再被氧化成Fe(OH)3* Fe (OH) 3，再脱水形成Fe3O4，离心分离，超纯水清洗即得到Fe3O 4磁性纳米粒子。为使所制备 的Fe3O4磁性纳米粒子更加稳定，在其表面包覆一层二氧化娃：用Stober法在Fe 304纳米粒 子表面包裹二氧化硅，即在乙醇和水的介质中，通过正硅酸四乙酯在碱性条件下水解生成 Si (OH) 4，最后以SiO2形式包裹在磁纳米表面；然后在反应体系中加入APTES反应24h，形成 氨基化Fe 3O4纳米粒子。
[0008] (2)核酸适配体修饰的Fe3O4磁性纳米粒子的制备
[0009] 取上述氨基化Fe3O4磁性纳米粒子分散于PBS缓冲溶液中，再加入戊二醛溶液，室 温下缓慢振荡2h，用PBS洗3次，再将粒子分散于avidin (125 μ g/mL)溶液，缓慢振荡12h， PBS洗3次并分散到PBS中，得到Avidin修饰的磁性纳米颗粒。生物素标记核酸适配体序 列为：Biotin-CCC CCC GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTA A。将 Avidin 修饰的磁性 纳米颗粒和生物素标记核酸适配体缓慢振荡12h后，利用永磁铁磁性分离，由于生物素与 亲和素之间的特异性相互作用，即得适配体修饰的Fe 3O4磁性纳米粒子。
[0010] (3)适配体修饰的磁纳米粒子对金黄色葡萄球菌的捕捉、分离与富集
[0011] 取ImL的液体样品与2mL适配体修饰磁纳米粒子进行混合，振荡孵育反应lOmin， 磁性分离，弃去上清液中的样品基质，磁性分离得到的产物用Tris-HCl缓冲液洗三次，将 其再悬浮于100 μ L Tris-HCl缓冲液中，即得到浓缩10倍后的被适配体化磁纳米捕获的金 黄色葡萄球菌悬菌液。
[0012] (4)金黄色葡萄球菌体内ATP的释放及生物发光法测定
[0013] 采用 TCA，BAB，CTAB，DMSO 或 SDS (优选 CTAB)的 3 % TCA 溶液作为 ATP 提取剂， 取20 μ L提取剂与100 μ L样品进行混合，轻微振荡反应2min，充分释放细菌体内的ATP 后，稀释20倍。取50 μ L稀释液与70 μ L浓度为50mg/mL的萤火虫荧光素与荧光素酶溶液 进行反应，MPI-E化学发光检测仪记录ATP生物发光相对发光值（RLU)与细菌浓度的对数 log (cfu/mL)建立的金黄色葡萄球菌检测的线性关系定量。
[0014] 本发明与现有技术相比，其显著优点是：
[0015] (1)核酸适配体对金黄色葡萄球菌具有特异性识别作用，且具有易合成、易修饰、 易固定、可反复使用和长期保存的优点。
[0016] (2)利用磁性纳米粒子完成对目标菌的结合、分离、富集和浓缩，不但可以有效去 除样品基质和其它干扰菌，而且可以提高检测的灵敏度
[0017] (3)采用优化的ATP生物发光检测法检测金黄色葡萄球菌，可以大大缩短检测时 间，已达到快速检测的目的。
[0018] (4)可快速、简单、灵敏、特异的检测食品中的金黄色葡萄球菌，简化样品前处理， 缩短了检测时间。
【附图说明】：
[0019] 附图1为：核酸适配体修饰的磁性纳米粒子捕捉生物发光检测金黄色葡萄球菌的 实验原理图。附图2为：Fe 3O4磁性纳米粒子与氨基化的Fe 304磁性纳米粒子的电镜图：(a) Fe3O4(WFe3O4-SiO2-NH 2。附图3 :核酸适配体化的磁性纳米材料捕获浓缩10后的金黄色葡 萄球菌溶液的标准曲线。
【具体实施方式】
[0020] 结合实施例对本发明作进一步地描述：
[0021] (1)通过溶剂热法合成Fe3O4磁性纳米粒子，并对其表面进行修饰。分析天平准确 称取0· 81g FeCl3 ·6Η20,2· 16g NaAC加入到30mL乙二醇中，50°C磁力搅拌，形成均一溶液。 与反应釜中反应200°C，6h。自然冷却后，用水和乙醇交叉洗各3次，于50°C真空干燥12h， 得到Fe 3O4磁性纳米粒子。
[0022] (2)利用改进的Stober法对Fe3O4磁性纳米粒子进行表面氨基化修饰。取30mg上 述合成的Fe 3O4磁性纳米粒子，加入100mL，0.1 M HC1，超声分散5min。再水洗2次，乙醇洗 1次。分散到126. 6mL无水乙醇和30mL超纯水中，机械搅拌（30转/分钟），加入I. 05mL 浓氨水，再超声5min。又继续机械搅拌，加入I. 08mL的TE0S，搅拌12h(时间越长，娃层越 厚）。乙醇洗5次，再分散到150mL无水乙醇中，再加入ImL的APTES，机械搅拌24h。乙醇 洗5次，真空干燥，得到Fe 3O4-SiO2-NH2。
[0023] (3)利用戊二醛法将氨基化的磁性纳米粒子与亲和素偶联。