一种γ-干扰素定量检测方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及体外诊断技术领域，尤其设及一种丫-干扰素定量检测方法及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 结核病是全球严重的公共卫生问题之一。据WK)估计，全球有约20亿人感染结 核分枝杆菌，每年有约200万人死于结核。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结 核感染导致的死亡人数是其他传染性疾病总死亡人数的2倍W上。结核病的临床表现多 样，可W累及全身各个系统，尤其是肺外结核病变往往十分隐匿，给临床诊断带来极大的困 难。传统的结核病诊断方法存在成本高、耗费时间长的问题，给结核患者和家庭带来沉重负 担。近年来，有一类用于诊断结核分枝杆菌感染的新方法进入了人们的视线，即丫 -干扰素 释放试验（interferongamma release assay, IGRA)，对结核患者的诊断带来了新的途径， 该方法准确率高，不要回访，逐渐被欧美等发达国家所采用。丫-干扰素是致敏的淋己细胞 再次受到抗原刺激时释放的一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过 细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制。该类试验采用ELISA/ 化ISP0T (酶联免疫吸附/酶联免疫斑点）方法定量检测检测全血/外周血单核细胞在结核 菌特异性抗原刺激下释放丫 -干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染W及结核 病。但是现有试剂盒在实现丫干扰素定量的同时，操作相对繁琐，中间设及多步的洗漆和 加样，浪费人力且容易造成污染。
[0003] 有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加W研究创新，W期创设一种丫-干扰素定量 检测方法及试剂盒，使其更具有产业上的利用价值。
【发明内容】
[0004] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种操作较为简单、同时有效实现丫 干扰素定量检测的丫-干扰素定量检测方法。
[000引本发明的丫-干扰素定量检测方法，包括W下步骤：
[0006] 1)捕获巧光微球的制备；采用碳二亚胺法制备，依次包括W下步骤：
[0007] a、将巧光微球悬液经洗漆液清洗后，加入偶联缓冲液、碳二亚胺和N服活化剂避 光下混匀；
[000引 b、加入抗人丫-干扰素抗体混匀避光下混匀；
[0009] C、加入封闭液后避光摇振后得到捕获巧光微球；
[0010] t将捕获巧光微球放入储存缓冲液中避光保存；
[0011] 2) 丫-干扰素的体外释放；采集结核菌特异性抗原刺激下的全血样本，经分装、培 养和离屯、后，收集血浆溶液；
[0012] 3)捕获巧光微球与丫-干扰素的结合；将步骤1)中得到的捕获巧光微球与步骤 2)中得到的血浆溶液混合，室温解育得到待检溶液；
[0013] 4)抗原抗体复合物的制备：在待检溶液中加入巧光素标记的抗人y-干扰素抗 体，室温解育得到抗原抗体复合物；
[0014] 5)定量检测：利用流式细胞仪对步骤4)制备的抗原抗体复合物进行检测。
[0015] 进一步的，还包括对照组检测酪蛋白溶液替代步骤2)中收集的血浆溶液，重 复步骤3)、4)和5)。
[0016] 进一步的，还包括标准曲线的制备；用样本稀释液倍比稀释丫-干扰素标准品W 替代步骤2)中收集的血浆溶液，重复步骤3)、4)和5)，根据不同浓度的丫-干扰素标准品 产生的巧光信号的强度不同绘制标准曲线。
[0017] 进一步的，所述抗人丫 -干扰素抗体为鼠源抗人丫-干扰素抗体。
[001引进一步的，所述巧光素标记的抗人丫-干扰素抗体为巧光素标记（APC-CY7)的兔 源抗人丫-干扰素抗体。
[0019] 本发明的另一目的是提供一种操作较为简单、同时有效实现丫干扰素定量的 丫-干扰素定量检测试剂盒，包括巧光微球、偶联缓冲液、碳二亚胺、N服活化剂、W及巧光 素标记的抗人丫-干扰素抗体。
[0020] 进一步的，还包括酪蛋白溶液和丫-干扰素标准品。
[0021] 借由上述方案，本发明至少具有W下优点；1)流式液相蛋白定量技术是借助流式 细胞仪通过抗原抗体反应和巧光标记法完成对可溶性蛋白进行定性定量的一种分析技术， 随着流式细胞仪的普及和广泛使用，W巧光微球作为载体的生物检测技术已经渗透到细胞 生物学、分子生物学、免疫学、医学等各个领域。由于流式细胞仪具有可根据微球粒径及所 带特征巧光信号对微球进行特异性识别的能力，因此可利用巧光微球结合流式细胞术建立 特异分子的检测技术。駿基巧光微球由于自身具有发光的特性，加上駿基可W和抗体的氨 基进行共价结合，从而具有特异的祀向性。本发明利用巧光微球标记抗丫-干扰素抗体结 合流式细胞术建立的丫-干扰素定量检测方法及试剂盒，具有操作较为简单、同时有效实 现丫干扰素定量检测的优点。2)本发明所采用的巧光微球具有粒径均一、稳定性好，比表 面积大、可通过化学偶联的方法和相应的抗体结合，实现了抗体的"细胞"化。3)只需一步 既可W实现丫-干扰素的快速定量检测，省去了传统方法的洗漆步骤，规避了在操作过程 造成交叉污染的风险，增加了检测结果的可信度。4)通过增加不同粒径大小的微球和相应 的目的抗体偶联，同时添加到同一个样本中，从而实现单一样本的多个项目的同时检测，省 时省力。
[0022] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明中抗原抗体复合物的模式图；
[0024] 图2是丫-干扰素标准品浓度为125pg/ml时的流式细胞分析图；
[0025] 图3是倍比稀释丫 -干扰素标准品的巧光值标准曲线；
[0026] 图4是本发明技术方法与国外相关试剂盒的相关性分析。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。W下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028] 实施例一
[0029] 本发明的丫-干扰素定量检测方法，包括W下步骤：
[0030] 1)捕获巧光微球的制备
[0031] 为了实现捕获微球的祀向性，需要对巧光微球进行抗丫-干扰素抗体的化学偶联 (碳二亚胺法）：
[00扣]a、取1 y L200-220nm的巧光微球（激发波长488nm)悬液（约1 X 1〇5个/ y L)用 洗漆液（PBS 0. Olmol/L，抑7. 4)洗一遍；
[003引 b、加入80化偶联缓冲液（化畔04,0. lmol/1，P册.。和10化碳二亚胺和 N服(5mg/mL)活化剂，混匀；
[0034] C、室温下避光摇振20分钟；
[00对 d、向活化微球中加入100 y 1(4 y g/mL)鼠源抗人丫 -干扰素抗体（购自 invitrogen)，混匀；
[0036] e、室温下避光摇振2小时；
[0037] f、用洗漆液洗3次；
[003引 g、加入 200 y L 封闭液（0. Olmol/1 PBS+1% BSA+0. 02% NaNs);
[0039] h、室温下避光摇振1小时；
[0040] i、将包被好的微球放在 800 y L 储存缓冲液（0. Olmol/lPBS+1 % BSA+0. 02% NaNs) 中4 °C避光保存。
[0041] 2) 丫-干扰素的体外释放
[0042] 本方法检测的丫-干扰素由结核菌特异性抗原刺激进行丫-干扰素的体外释放， 体外释放的丫-干