一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属基因工程技术、诊断试剂领域，尤其设及一种化ISA检测人血清HCMV ppl50 IgM抗体试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒（Human切tomegalovirus，HCMV)属于人类瘤疹病毒0亚科病毒， 在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布，血清流行病学调查表明，40-100 %成人有HCMV 抗体。目前的研究表明HCMV是人类先天性感染最常见的病原体之一，对孕妇及胎儿影响巨 大，孕期的HCMV原发感染危害尤为巨大，2/3先天性感染是由孕期原发感染造成的。先天性 感染中90%的患儿不表现临床症状，5% -10%可造成流产、死胎、胎儿崎形、发育迟缓及迟 发性中枢神经系统缺陷等疾病。此外，HCMV感染也是器官移植失败和艾滋病病人并发感染 死亡的主要原因之一。
[0003] 快速准确的诊断和监测HCMV感染状态的方法在临床上是急需的，在一些特定的 人群中尤为重要，比如器官移植手术中的供体和受体，育龄妇女W及接受免疫抑制剂治疗 的人群等。HCMV在免疫力正常人群中通常呈现无症状感染，病毒复制受到抑制，有间歇性 排毒现象存在。而在HCMV活动性感染中，病毒大量复制，可在血液，尿液，脑脊液等检测到 活病毒。病毒分离是诊断HCMV活动性感染最重要的指标之一。但是由于病毒自身的复制 特点，病毒分离实验周期较长。而且病毒分离实验本身操作繁琐，对实验条件，设备有一定 的要求，不适用于临床对该病毒的及时监测及诊断。血清中HCMV特异的IgM抗体是诊断新 近感染的重要指标，IgM抗体在机体病毒原发感染3-5天即可出现，持续12-16周时间。采 用ELISA试剂盒检测HCMV特异的IgM抗体，检测方法简单，实验周期短，可重复性高，适用 于临床诊断。
[0004] 捕获法用于检测血清中HCMV特异的IgM抗体原理是，采用抗人IgM y链特异性 单克隆抗体包被酶标反应板，能与血清中的IgM抗体特异性结合。再加入辣根过氧化物酶 (HRF0标记的抗原，加入底物反应一定的时间并终止反应。在一定的范围内，吸光度值（0D) 的大小体现血清样品中IgM抗体的含量多少。相对于间接法，捕获法不受血清中高滴度的 IgG抗体影响，特异性更好。
[0005] HCMV PP150是瘤疹病毒0亚科特有基因，在HCMV众多结构蛋白质中PP150是免 疫原性最强的，是刺激机体产生体液免疫的主要祀抗原，也是杀伤性T淋己细胞（CTL)主 要识别抗原。在病毒感染的恢复期，血清中针对PP150的抗体存在时间较针对其他抗原的 抗体存在时间长。HCMV PP150还是能够刺激机体产生IgM为数不多的CMV抗原之一。因 此采用该蛋白作为捕获法酶标抗原不仅可W保证检测方法的可靠性还可W减少瘤疹病毒 之间的交叉反应，从而提高检测方法的特异性。通过缺失突变株的构建证实PP150对病毒 在细胞质中的包装成熟至关重要，PP150缺失突变株基因复制能够正常进行，但是病毒不 能完成最终的包装，也不能够感染邻近的细胞。完整的PP150由1048个氨基酸组成，含有 多个抗原表位。但是通过截短表达或者单独表达该些抗原表位发现，他们并不是都能够和 CMV阳性血清反应。已有的研究还表明，单纯的串联表达同一抗原表位不能够增强该抗原 的免疫原性和免疫反应性，而将不同的抗原表位串联表达可W很好的增强其免疫原性和免 疫反应性。鉴于此，我们采用融合PCR的方法，将HCMVPP150的两个优势抗原表位（肤段 aa495-691，aa862-1048)的编码区域直接连接起来插入祀T32(b)表达载体，导入大肠埃希 氏菌化2UDE3)。经诱导表达获得截短PP150蛋白。用该蛋白作为捕获法检测IgM抗体的 ELISA试剂盒的酶标抗原，包装的试剂盒与德国DiaSorin公司的HCMV IgM检测试剂盒W及 国内某公司的HCMV IgM试剂盒比较。W德国DiaSorin公司的HCMV全病毒包装IgM检测试 剂盒做为标准，结果显示；本项目发明试剂盒特异性为100 %，敏感性为95. 6 %，均优于国 内某公司的HCMV IgM试剂盒（分别为95. 7%和86. 9% )。敏感性虽略低于德国DiaSorin 公司的HCMV全病毒包装IgM检测试剂盒（100% )，但是特异性高于德国DiaSorin公司的 HCMV全病毒包装IgM检测试剂盒巧8. 9% )。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是现有临床检测技术的不足，提供一种通过化ISA方法快速检测样 品中HCMV I gM抗体的试剂盒。
[0007] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
[000引一种ELISA检测人血清肥MV PP150 IgM抗体试剂盒，其特征在于；使用的酶标抗 原是辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV PP150。
[0009] 所述的一种化ISA检测人血清肥MV ppl50 IgM抗体试剂盒，其特征在于；所述的 辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV PP150的制备方法为：
[0010] A、HCMV PP150重组蛋白获取
[0011] (1)根据Genebank中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV PP150基因编码序列，设 计用于扩增aa495-691和aa862-1048的融合PCR引物，W肥MV AD169株DNA为模板，扩增 出的目的片段大小为115化P，将其克隆到祀T3化载体上，构建重组质粒祀T3化/ppl50,在 通过DNA测序获得肥MV PP150基因核酸序列正确的重组载体，转化大肠杆菌化21 0E3)， 经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS - PAGE蛋白电泳及Western blotting鉴定；
[0012] (2)将表达HCMV PP150重组蛋白的大肠杆菌经过大量培养至对数期，加IPTG诱导 5小时，离屯、收集菌体，破碎后120(K)巧m超速离屯、30min收集上清，亲和层析纯化后得到大 量HCMV PP150重组蛋白；
[0013] B、辣根过氧化物酶标记抗原重组蛋白HCMVppl50
[0014] (1)称取 4. 8-5. 2mgHRP 溶解于 0. 8-1. 2ml 蒸馈水中；
[0015] (2)于步骤（1)所得溶液中加入0. 15-0. 25ml新配的0. 05-0. 15M的化1〇4溶液， 室温下避光揽拌15-25分钟；
[0016] (3)将步骤（2)所得溶液溶液装入透析袋中，对0. 5-1. 5mM PH4. 3-4. 5的醋酸钢缓 冲液透析，3-5°C下放置6-8小时，得醒化HRP ;
[0017] (4)加20 y 1 0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使W上醒化HRP的PH升高到9. 0-9. 5， 然后立即加入lOmg纯化后的HCMV PP150重组蛋白在1ml 0. 01M碳酸盐缓冲液中，室温避 光轻轻揽拌2小时；
[001引 妨加0. 1ml新配的4mg/ml化肌4液，混匀，再于4°C下放置2小时；
[0019] 做将上述溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4 PBS透析，4°C过夜；
[0020] (7)在揽拌下逐滴加入等体积饱和硫酸锭，4°C下放置1小时；
[0021] (8) 3000rpm离屯、半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸锭洗二次，最后沉淀物溶于 5ml 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；
[0022] (9)将上述溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PBS缓冲盐水透析，去除锭离 子后，10000巧m离屯、30分钟去除沉淀，上清液即为辣根过氧化物酶标记抗原重组蛋白 HCMV卵150,分装后，-20°C左右保存。
[002引所述的一种化ISA检测人血清肥MV PP150 IgM抗体试剂盒，其特征在于；本试剂 盒由抗人IgM y链抗体包被酶标反应板、标本稀释液、洗漆液、酶标抗原、显色液、终止液、 阳性对照、阴性对照构成。
[0024] 所述的一种化ISA检测人血清肥MV ppl50 IgM抗体试剂盒，其特征在于；所述的 阳性对照是临床确诊为HCMV IgM阳性的血清；阴性对照是临床确诊为HCMV IgM阴性的血 清；标本稀释液指的是含10%小牛血清和血浆显色剂的0. 01M pH7. 4的磯酸盐缓冲液；洗 漆液指的是含有0. 05% Tween 20的磯酸盐缓冲液；酶标抗原为辣根过氧化物酶标记的重 组蛋白HCMV PP150 ;显色液为TMB-H2O2尿素溶液；终止液为2mol/L H2SO4溶液。
[0025] 所述的一种化ISA检测人血清HCMV PP150 IgM抗体试剂盒，其特