一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学纳米材料技术领域，具体涉及一种纳米壳聚糖衍生物富集和 纯化糖基化多肽的方法。
【背景技术】
[0002] 翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研宄的热点课题，其中蛋白质的糖基化是最 常见、最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。蛋白质的糖基化几乎调节着生命活动的整个 过程，包括细胞的增殖，发育和分化，新陈代谢，免疫应答，肿瘤发生等。一些糖基化蛋白质 作为治疗疾病的相关靶或生物标识物用于癌症的早期检测和鉴定，如癌胚抗原用于检测直 肠癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA-125用于检测卵巣癌；专一性前列腺癌胚抗原用于检测 前列腺癌；Her2/neu用于检测乳腺癌等。
[0003]目前，质谱技术已经发展成为鉴定糖基化蛋白的重要工具之一。但是质谱在鉴定 糖基化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，糖基化蛋白在细胞内所有蛋白中 为低丰度；第二，酶解产物中存在的大量非糖基化多肽的质谱信号通常会淹没糖基化多肽 的离子信号。鉴于此，当前国际上的主要研宄策略是利用现有技术体系，分离富集糖蛋白质 /糖肽，实现大规模高通量蛋白质的糖基化位点的鉴定。
[0004] 蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即不同的糖链可连于同一位点，同一 蛋白质上也可有不同的位点连接不同的糖链。糖基化的不均一性给糖蛋白质的分离分析带 来了很大的困难：不同糖型的同一蛋白质会在电泳上呈现弥散的条带，导致信号分散，较低 丰度的蛋白质得不到鉴定，造成糖蛋白质在色谱中不能良好的分离。
[0005] 目前，常用的糖蛋白质分离富集技术有：凝集素亲和技术、肼化学富集法、苯硼酸 亲和法、亲水相互作用色谱法等。其中a)凝集素亲和技术对含甘露糖基和N-混多糖的糖 蛋白具有较好的亲和作用，但是对二触角的N-多糖糖蛋白的亲和作用较弱，对三，四触角 的N-多糖糖蛋白没有亲和作用；b)肼化学富集法需一步氧化反应，从而增加了样品制备时 间和样品的复杂性；c)含苯硼酸的材料，对含有N-糖基化和0-糖基化的糖蛋白都具有较 好的富集作用，但是对免疫球蛋白的Fc端的糖肽没有富集作用；d)最近开发的金属氧化物 1102和Ti-IMAC主要对含有唾液酸的糖基化多肽具有富集作用。
[0006] 壳聚糖（Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨 基-0-1，4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解 性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医 药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉（R.Jayakumaretal.Carbohydrate Polymers62(2005) 142 - 158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。
[0007] 在专利ZL200910086838. 6中，报道了含苯硼酸的纳米壳聚糖衍生物、制备方法 及其在富集和纯化糖基化多肽/蛋白方面的应用；但是该衍生物对免疫球蛋白（IgG)的Fc 端的糖肽没有富集作用。在ZL200810179716. 7中报道了一种纳米壳聚糖衍生物、制备方 法及其在富集和纯化磷酸化多肽方面的应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法。
[0009] 本发明所述纳米壳聚糖衍生物为专利ZL200810179716. 7中所述的纳米壳聚糖 衍生物，其颗粒大小为l_300nm，固载基质为壳聚糖；该衍生物带有活性羧基官能团，并与 过渡金属离子Ti4+络合。
[0010] 所述活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。
[0011] 上述纳米壳聚糖衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法，是将酶解后的待分析物溶 于上样液中，将其加入到纳米壳聚糖衍生物中进行富集，洗涤后得到选择性吸附有糖基化 多肽的纳米壳聚糖衍生物，直接用于质谱分析（例如MALDI-TOF-MS)或洗脱负载的糖基化 多肽。
[0012] 吸附结合的糖基化多肽可用糖解酶将糖基与多肽解离，从上述纳米材料中洗脱下 来。
[0013] 所述上样液为含有80%乙腈和5%三氟乙酸的水溶液，且其中含有一定量的 2, 5-二羟基甲酸（DHB)、邻苯二甲酸或羟基乙酸等。洗脱负载的糖基化多肽时所用的洗脱 溶液为5%?10%的氨水溶液或含有10%?50%乙腈、5%甲酸的水溶液。
[0014] 酶解时所用的酶为胰酶，蛋白内切酶Glu-C或糜蛋白酶。
[0015] 待分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液。
[0016] 此外，将上述纳米壳聚糖衍生物涂在芯片上进行微量的糖基化多肽的富集和纯 化，或填充入色谱柱中进行大规模的糖基化多肽的富集和纯化。
[0017] 本发明的有益效果：本发明的纳米壳聚糖衍生物相对于现有材料而言，所选材料 廉价易得，具有良好的生物相容性，性质稳定，颗粒大小为l-300nm，外比表面积大，具有很 强的吸附能力，可制膜和填充于色谱柱中，富集糖基化多肽后可直接用于质谱分析，无需脱 盐。所述纳米壳聚糖衍生物既含有糖链也含有金属Ti4+离子，因此该纳米壳聚糖衍生物能 高选择性、特异性地富集和纯化糖基化多肽。此外，纳米壳聚糖衍生物不仅能够富集含唾液 酸的糖基化多肽（如IgG)，而且能富集不同糖基的多肽（如HRP)。所述纳米壳聚糖衍生物 可用于生物样品中低丰度的糖基化多肽的富集和纯化，可用于生物和医学领域，包括临床 诊断。
【附图说明】
[0018] 图1为纳米壳聚糖衍生物的透射电镜图；由图可以看出，此纳米材料为球型，颗粒 大小为20-60nm，外表与金属Ti4+结合。
[0019] 图2A为辣根过氧化物酶酶解产物（浓度为2X10_8M)的MALDI-TOF质谱图；图2B 为纳米壳聚糖衍生物对辣根过氧化物酶酶解产物中糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF 质谱图。
[0020] 图3A为免疫球蛋白（IgG)酶解产物（浓度为2X10_6M)的MALDI-TOF质谱图；图 3B为纳米壳聚糖衍生物对IgG酶解产物中糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图；图 3C为图3B的放大图；图3D为IgG糖基化多肽用PNGaseF去糖基后的MALDI-TOF质谱图。
[0021] 图4A为0-酪蛋白酶解产物（浓度为1X10_6M)的MALDI-TOF质谱图；图4B为纳 米壳聚糖衍生物对0 -酪蛋白酶解产物中磷酸化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图。
[0022] 图5A为0 -酪蛋白酶解产物和辣根过氧化物酶酶解产物的MALDI-T0F质谱图；图 5B为纳米壳聚糖衍生物对其进行磷酸化多肽和糖基化多肽富集和纯化的MALDI-T0F质谱 图。
[0023] 图6A为0 -酪蛋白酶解产物和IgG酶解产物的MALDI-T0F质谱图；图6B为纳米 壳聚糖衍生物对其进行磷酸化多肽和糖基化多肽富集和纯化的MALDI-T0F质谱图。
[0024]图7为IgG糖基化多肽的结构分析图。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过实施例结合附图对本发明给予进一步的说明。
[0026] 实施例1-15为利用纳米壳聚糖衍生物进行富集和纯化糖基化多肽和磷酸化多 肽，其中所述纳米材料为本发明的纳米壳聚糖衍生物。
[0027] 实施例1
[0028] 辣根过氧化物酶（HRP)的糖基化多肽的富集及其分析
[0029] 1)样品溶液的制备：25yg辣根过氧化物酶（Sigma)加入10yL含8M尿素，乙二 胺四乙酸（EDTA)和10mM磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP)，在室温振动1小时，再加入40yL 50mM的碳酸氢氨溶液中（pH8. 2)，按照与胰蛋白酶的质量比为（40:1)的比例加入胰蛋白酶 进行酶解反应，酶解温度控制在37°C，过夜反应，加入2%三氟乙酸（TFA)终止反应。获得 的蛋白酶解溶液储存在-80 °C冰箱中备用。
[0030] 2)糖基化多肽的富集和MALDI-T0F质谱分析：将2yL1X10_6mM的辣根过氧化物 酶酶解溶液溶于100uL上样液中，其中，上样液为含80%乙腈和5%三氟乙酸的水溶液，加 入到装有约0. 5mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30°C，振速为lOOOrpm下，振动30分 钟，离心去上清液，用80%乙腈和1 %三氟乙酸的水溶液洗涤一次即可用于质谱分析。吸取 0? 5yL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与0? 5yL含1 %H3P04和50 % 乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱 图，所有的