一种检测醛酮类化合物的方法与流程

本发明涉及一种检测醛酮类化合物的方法，特别涉及一种以丹磺酰肼作为醛酮类化合物转化试剂，通过荧光检测醛酮类化合物的方法，属于分析检测技术领域。

背景技术：

醛酮类物质是常见常用的化学试剂，包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丙酮等等，这些属于小分子、低沸点醛酮，易被释放到空气中或转移到接触物上直接或间接地导致多种疾病。其中，甲醛对人体的鼻腔、肺、造血系统均可造成损伤，并提高各个部位患癌的风险，国际癌症研究机构(IARC)已经将甲醛归于可疑致癌物类。其它醛酮长期接触，会在一定程度上损害健康，甚至引发一系列的并发症。

目前，国内外常用的醛酮的检测方法是2,4-二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生－HPLC/PDA进行检测，其衍生原理如下反应方程式1，行业内相关的常用检测方法也是基于此原理进行的。但是基于PDA检测器灵敏度的限制，其检测限均处于一个较高数值的水平，对于样品中较低浓度的醛酮的检测与监控无法达到。

其中，R₁和R₂独立选择氢、甲基乙基等；

反应方程式1：DNPH衍生醛酮原理

而荧光检测器(FLD)灵敏度要比PDA检测器高，但荧光检测器对衍生化试剂的选择有较高的要求，需要其自身能发出荧光或者产物能发出荧光，因此，寻找合适的衍生化试剂是实现荧光检测醛酮类化合物的关键。

技术实现要素：

针对现有的PDA检测醛酮类化合物的方法存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种方法简单，灵敏度高，检出限低的低含量醛酮的分析检测方法，该方法基于荧光检测醛酮类化合物，能很好地应用到实际生活中样品的检测，有利于推广应用。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种检测醛酮类化合物的方法，在酸性条件下，将醛酮类化合物与丹磺酰肼反应，得到腙类化合物；所述腙类化合物通过高效液相色谱分离后，采用荧光检测器进行定性定量分析。

本发明的技术方案首次选用丹磺酰肼(DNSH)作为醛酮类化合物的转化试剂，使醛酮类化合物转化成可用于高效液相色谱标记，且能被荧光检测器检测的腙类化合物，以实现高效液相色谱分离及荧光检测(FLD)，以达到高灵敏度和低检出限检测醛酮类化合物的目的。

本发明技术方案，在酸性介质存在条件下，DNSH易于与醛酮类化合物发生反应生成相对稳定的腙类化合物，由于其结构本身包含具有大的共轭结构，可用于高效液相色谱标记，且能被荧光检测器检测。DNSH与醛酮类化合物的反应机理如反应方程式2。本发明的技术方案正是利用该原理建立了检测醛酮类化合物的方法，该方法具有简单，灵敏度高，检出限低等特点，为低含量醛酮的检测提供方法依据。

反应方程式2：DNSH衍生醛酮原理

优选的方案，醛酮类化合物与丹磺酰肼在冰醋酸/乙腈混合溶液中反应，得到腙类化合物。DNSH易溶于极性溶剂如乙醇、乙腈等，但极易在水中分解，稳定性差，本发明的技术方案在非水溶剂中进行反应。同时，丹磺酰肼氨氮上含有活性较强的孤对电子，在酸性条件下，能进攻羰基碳，发生亲核加成反应。

较优选的方案，反应温度为5～45℃，反应时间为12～30h。

较优选的方案，醛酮类化合物包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丙酮中至少一种。

较优选的方案，所述高效液相色谱采用的液相色谱柱型号：C18(2)，4.6mm×250mm，5μm；

流动相A：水，流动相B：乙腈；

洗脱程序：梯度洗脱，0min，55vol％A+45vol％B；12min，55vol％A+45vol％B；15min，40vol％A+60vol％B；20min，10vol％A+90vol％B；21min，55vol％A+45vol％B，25min，55vol％A+45vol％B；

流速：1.0mL·min^-1；

进样量：10μL；

柱温：30℃。

较优选的方案，荧光检测器为2475荧光检测器，检测波长λex＝330nm，λem＝484nm。

本发明的技术方案中，丹磺酰肼采用醋酸/乙腈溶液配制成浓度为500mg·L^-1的丹磺酰肼溶液，具体配制方法为：准确称取丹磺酰肼(DNSH)25mg到50mL棕色容量瓶中，加入适量3％(体积百分数)冰醋酸/乙腈混合溶液，振荡使DNSH完全溶解后，用冰醋酸/乙腈混合溶液定容至刻度。

本发明的技术方案可以用于检测样品中的醛酮类化合物，如纸张等，样品中的醛酮类化合物先采用乙腈提取，再采用丹磺酰肼溶液使醛酮类化合物转化成可以进行荧光检测的腙类化合物。以检测纸张中醛酮类化合物含量进行具体说明：称取待测样品(如纸张)1.5g于50mL具塞锥形瓶中，往锥形瓶中加入乙腈15mL，振荡萃取30min，静置后取约8mL上层清液到10mL离心管，于12000r/min转速下离心10min，取离心后的上层清液5mL到装有2mL丹磺酰肼溶液和90μL冰醋酸的10mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，反应24h，过0.45μm有机相滤膜后，采用高效液相色谱分析及荧光检测。

本发明的荧光检测过程中标准工作液的配制方法：

1)混合标准储备液的配置

准确移取磺酰肼溶液5mL到10mL棕色容量瓶中，再分别准确移取各醛酮类化合物标准品各20μL到上述容量瓶中，振荡混匀后，用乙腈溶液定容至刻度，配置成各醛酮类化合物的腙类化合物浓度均为2mg·L^-1的一级混合标准储备液。准确移取5.00mL一级混合标准储备液到10mL棕色容量瓶中，用1.5vol.％冰醋酸/乙腈溶液定容至刻度，作为二级混合标准储备液。

2)混合标准工作液的配置

分别准确移取0.100、0.200、0.500、1.000、2.000、4.000mL二级混合标准储备液到10mL棕色容量瓶中，用1.5vol.％冰醋酸/乙腈溶液定容至刻度，得到浓度分别为10.000、20.000、50.000、100.000、200.000、400.000μg·L^-1混合标准工作液。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：本发明的技术方案首次选用丹磺酰肼(DNSH)作为醛酮类化合物的转化试剂，使醛酮类化合物转化成可用于高效液相色谱标记，且能被荧光检测器检测的腙类化合物，实现了醛酮类化合物的荧光检测(FLD)，具有简单，灵敏度高，检出限低等特点，为低含量醛酮类化合物的检测提供方法依据。

附图说明

【图1】工艺流程图。

【图2】为标准溶液和某纸张样品中5种选择的醛酮类化合物的色谱图；

其中，1为甲醛-丹磺酰腙，2为乙醛-丹磺酰腙；3为丙酮-丹磺酰腙；4为丙醛-丹磺酰腙；5为丁醛-丹磺酰腙。

具体实施方式

以下以DNSH衍生-HPLC/FLD法同时测定某纸张中的五种醛酮的测定方法为例，对本发明进行进一步的说明，而不会限制本发明权利要求保护范围。

实施例1

1、仪器、试剂与材料

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配备自动进样器，四元泵，柱温箱和2475荧光检测器；BSA224S-CW分析天平(德国Sartorius电子天平公司)；HY-6双层调速振荡仪(国华电器有限公司)；KQ-600DE型数控超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；TGL-16M台式离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)；1uL-5mL活塞式移液枪(德国Eppendorf公司)；C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)液相色谱柱。

试剂：

表1标准品及试剂

所用水为超纯水。

2、溶液的配制

DNSH溶液：准确称取丹磺酰肼(DNSH)25mg到50mL棕色容量瓶中，加入适量3％(体积百分数)冰醋酸/乙腈混合溶液，振荡使DNSH完全溶解后，用该溶液定容至刻度。DNSH溶液中DNSH浓度为500mg·L^-1。

混合标准储备液的配制：准确移取衍生化试剂5mL到10mL棕色容量瓶中，再分别准确移取甲醛、乙醛、丙酮、丙醛、丁醛标准品各20μL到上述容量瓶中，振荡混匀后，用乙腈溶液定容至刻度，配置成甲醛－腙、乙醛－腙、丙醛－腙、丁醛－腙、丙酮－腙浓度均为2mg·L^-1的一级混合标准储备液。准确移取5.00mL一级混合标准储备液到10mL棕色容量瓶中，用1.5％冰醋酸/乙腈混合溶液定容至刻度，作为二级混合标准储备液。

混合标准工作液的配制：分别准确移取0.100、0.200、0.500、1.000、2.000、4.000mL二级混合标准储备液到10mL棕色容量瓶中，用1.5％冰醋酸/乙腈混合溶液定容至刻度，得到浓度分别为10.000、20.000、50.000、100.000、200.000、400.000μg·L-1混合标准工作液。于4℃冰箱中避光保存，有效期3个月。

3、样品前处理

称取按规定裁剪纸张碎片1.5g于50mL具塞锥形瓶中，往锥形瓶中加入乙腈15mL，振荡萃取30min，静置后取约8mL上层清液到10mL离心管,于12000r/min转速下离心10min，取离心后的上层清液5mL到装有2mL衍生化试剂和90μL冰醋酸的10mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，衍生化反应24h，而后过0.45μm有机相滤膜待高效液相色谱分析。

4、检测

仪器条件

液相色谱柱：C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)；检测器：2475荧光检测器,λex＝330nm，λem＝484nm；流动相A：水，流动相B：乙腈；洗脱程序：梯度洗脱，0min，(55％A+45％B)，12min，(55％A+45％B)，15min，(40％A+60％B)，20min(10％A+90％B)，21min，(55％A+45％B)，25min，(55％A+45％B)；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；柱温：30℃。采用保留时间定性，外标法定量。

分析检测步骤：

在色谱条件下对系列标准工作液进行测定，根据测得的峰面积(μV*S)对其质量浓度ρ(μg·L-1)进行线性回归，以峰面积(μV*S)为Y轴，以质量浓度ρ(μg·L-1)为X轴作图，得到线性回归方程。各醛酮的线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限和定量限见表2，方法的加标回收率及精密度见表3。

表2线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限及定量限

表3方法回收率及精密度结果(n＝5)

纸张样品的检测：在相同条件下对样品进行检测，将得到的待测5种醛酮化合物的色谱峰面积带入相应的标准曲线回归方程中，即可得到样品中相应的5种醛酮化合物的含量。

5、含量计算

某纸张中5种醛酮化合物的测定结果，按照下列公式计算：

q＝c×V/m

式中：

q为纸张中5种醛酮化合物含量，单位为μg/kg；

c为纸张中5种醛酮化合物的浓度，单位为μg/L；

V为萃取液体积(mL)；

m为称的取纸张样品重量，单位为g。

试验样品中5种醛酮化合物含量的测定采用本发明方法，测定结果如表4所示：

表4纸张样品分析结果

注：“－”表示低于定量限，未检出。