本发明涉及式1所示水杨酸酰胺衍生物DHMEQ软膏剂，以及其质量分析方法。该水杨酸酰胺衍生物可供治疗癌症、炎症、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并发症、感染、心血管疾病和缺血再灌注损伤。
背景技术：
核因子κB(NF-κB，Nuclear factor-kappa B)活化参与各种疾病，包括癌症、糖尿病、心血管疾病、自身免疫疾病、病毒复制、脓毒性休克、神经变性疾病、运动失调性毛细血管扩张症(AT)、关节炎、哮喘、炎性肠病和其它炎性病症。例如，革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)活化NF-κB可产生脓毒性休克，因为NF-κB过度激活许多细胞因子和修饰酶的转录，它们的表达延长可不利地影响关键器官，例如心脏和肝脏的功能(Arcaroli等.，2006；Niu等.，2008)。
类似地，自身免疫疾病，例如全身性红斑狼疮也可能涉及NF-κB的活化。NF-κB转录因子对于适当的树突细胞成熟至关重要，其丧失是全身性红斑狼疮的标志(Kalergis等.，2008；Kurylowicz和Nauman，2008)，此外，在慢性阿尔茨海默病中，淀粉样蛋白β肽导致反应活性氧中间体的产生，通过NF-κB位点间接活化基因表达(Giri等.，2005)。
骨的破坏性侵蚀或骨质溶解是炎性病症，例如类风湿性关节炎(RA)、牙周病和假体周围骨质溶解的主要并发症。RA是影响约1.0％美国成年人的自身免疫疾病，女性和男性之比是2.5到l(Lawrence等.，1998)。其标志是导致主要病态的渐进性关节破坏。牙周病非常普遍，影响全球高达90％的人口。众所周知其是成年人牙齿丧失的主要原因(Pihlstrom等.，2005)。尽管很普遍，但牙周骨侵蚀的发生机制仍不清楚，虽然看来是宿主对口腔中存在的病原微生物的反应触发该过程。外源性植入物器件周围的慢性骨再吸收作用导致假体周围骨质溶解，直至丧失固定作用(Harris，1995)，据信其是针对磨损碎片颗粒的先天免疫反应所致，获得性免疫系统影响不大(Goldring等.，1986)。
虽然这些病症由不同原因引发，通过各种途径而进展，但这些病症的病理性过程中的重要共同因素是发炎组织中NF-κB途径的组成型活化驱动的促炎性细胞因子过度产生。与全身性、激素调控的骨病理状况，例如骨质疏松症不同，这些病症中发现的骨侵蚀大多定位于发炎的组织。在许多这些疾病中发现，这些发炎组织还产生促炎细胞因子，即，TNF-α、IL-1和IL-6，这些促炎细胞因子进而参与破骨细胞分化信号传导和骨再吸收活性。因此，炎性骨质溶解是发炎组织中NF-κB驱动促炎细胞因子推动的破骨细胞募集和活化增强所致。
炎性肠病(IBD)包括涉及胃肠道的许多慢性复发性炎性疾病。IBD的两种最常见的形式是克罗恩病和溃疡性结肠炎，二者的区别在于独特的组织病理学特性和免疫应答(Atreya等.，2008；Bouma和Strober，2003)。目前的治疗疗效有限，还可能有副作用使得患者和医生渴望能控制这些疾病的慢性复发性炎症性质的新疗法。
虽然导致克罗恩病和溃疡性结肠炎的确切病因尚未知，但通常认为是粘膜免疫系统对正常肠菌群的不当和正进行的活化导致(Tilg等.，2008)。因此，驻留型巨噬细胞、树突细胞和T细胞活化并开始主要分泌NF-κB-依赖性趋化因子和细胞因子。NF-κB介导关键促炎介质的过度产生导致人IBD和结肠炎动物模型的启动和进展(Neurath等.，1998；Wirtz和Neurath，2007)。具体地说，IBD患者的巨噬细胞表现出高水平的NF-κB DNA结合活性并伴有白介素(IL)l、IL6和肿瘤坏死因子TNFα的产生增加(Neurath等.，1998)。此外，NF-κB在活化T辅助细胞l(Thl)和T辅助细胞2(Th2)细胞因子中起到关键作用，二者是促进和维持炙症所需(Barnes，1997)。由于NF-κB在IBD中起到的核心作用，人们付出大量努力试图开发靶向该途径的疗法。
NF-κB显示在来自乳腺、卵巢、结肠、胰腺、甲状腺、前列腺、肺、头颈、膀胱和皮肤肿瘤的许多癌症衍生细胞系中组成型表达(Calzado等.，2007)。B-细胞性淋巴瘤、霍奇金病、T-细胞性淋巴瘤、成人T细胞白血病，急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病中也观察到。NF-κB作为防御性应答的一部分是正常炎症的关键介质；然而，慢性炎症可导致癌症、糖尿病和许多上述其它疾病。己鉴定了几种促炎基因产物在致癌过程、血管发生、侵袭和肿瘤细胞转移中介导关键作用。这些基因产物有TNF-α及其超家族的成员，IL-1α、IL-1D、IL-6、IL-8、IL-18、趋化因子、MMP-9、VEGF、COX-2和5-LOX。所有这些基因的表达主要由转录因子NF-κB调控，其在大多数肿瘤中有组成型活性并由致癌物(例如香烟的烟)、肿瘤促进剂、致癌性病毒蛋白(HIV-tat、KHSV、EBV-LMP1、HTLVl-tax、HPV、HCV和HBV)、化疗剂和γ射线诱导(Aggarwal等.，2006)。这些观察结果暗示抑制NF-κB的抗炎剂应该可能用于预防和治疗癌症。
流感病毒蛋白血凝素还活化NF-κB，该活化可导致细胞因子的病毒诱导和一些流感相关症状(Flory等.，2000；Pahl和BaeueR1e，1995)。
动脉粥样硬化相关的低密度脂蛋白的氧化脂质活化NF-κB，然后活化其它基因，例如炎性细胞因子(Liao等.，1994)。此外，动脉粥样硬化易感小鼠在喂食致动脉粥样硬化饮食时显示NF-κB活化，因为它们对脂质过氧化产物累积、炎性基因诱导和NF-κB转录因子活化相关的动脉粥样硬化病损形成敏感(Liao等.，1994)。动脉粥样硬化的另一重要原因是凝血酶，其通过NF-κB活化而刺激血管平滑肌细胞增殖(Maruyama等.，1997)。IκB阻遏蛋白的截短形式(IκBα)显示是电离辐射超敏性的原因，在组成型水平NF-κB-活化的运动失调性毛细血管扩张症(AT)细胞中其对DNA合成调控有缺陷(Jung等.，1995)。AT细胞的IκBα中的该突变显示导致NF-κB途径组成型活化的阻遏蛋白灭活。鉴于所有这些发觋，NF-κB的异常活化或表达明显与各种病理学状况相关。
人单核细胞中，HIV-1的感染和生命周期与NF-κB途径紧密相连。病毒感染导致NF-κB活化，从而产生AIDS标志性的T细胞过度刺激和最终耗尽(综述见(Argyropoulos和Mouzaki，2006)。例如，NF-κB调节作为HIV-1关键受体的CCR5的表达(Liu等.，1998)。CCR-5启动子的缺失分析证明3’-远端NF-κB/AP-l位点的丧失使得转录降低>95％(Liu等.，1998)。这些研究提示NF-κB的组成型表达导致CCR-5受体信息急剧降低。由于靶T-细胞表面上CCR5的表达水平影响HIV-1进入动力学特性(Ketas等.，2007；Platt等.，1998；Reeves等.，2002)，下调CCR5可约束大量产生病毒库的感染细胞群扩散。还有报道说NF-κB影响CXCR4表达(Helbig等.，2003)，提示NF-κB抑制剂可能同样有效抗感染后期期间出现的X4-向性分离物。整合的DNA-前-病毒的转录需要NF-κB(Baba，2006；Iordanskiy等.，2002；Mukerjee等.，2006；Palmieri等.，2004；Rizzi等.，2004；Sui等.，2006；Williams等.，2007)。事实上，缺乏NF-κB活化导致具有潜伏病毒的细胞群产生，这是消除受感染患者的病毒的主要障碍(Williams等.，2006)。
NF-κB促进超过150种靶基因对炎性刺激物起反应而表达。这些基因包括白介素-1、-2、-6和肿瘤坏死因子受体(TNF-R)(这些受体介导凋亡并起到炎症调节剂的作用)以及编码免疫受体、绌胞粘附分子和酶，例如环加氧酶-II和诱生型-氧化氮核酶(iNOS)的基因(Karin，2006；Tergaonkar，2006)。其还在病毒感染，例如HCV和HIV-1相关疾病的进展中起关键作用。
NF-κB家族的成员包括RelA/p65、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κBl)和p52/pl00(NF-κB2)(Hayden和Ghosh，2004；Hayden等.，2006a；Hayden等.，2006b)。Rel家族成员作为同源二聚体或异源二聚体起作用，对位于NF-κB-调节基因的启动子结构域内的顺式结合元件的特异性不同(Bosisio等.，2006；Natoli等.，2005；Saccani等.，2004)。经典NF-κB-由RelAlp65和p50异源二聚体构成，是NF-κB研究得最清楚的形式(Burstein和Duckett，2003；Hayden和Ghosh，2004)和其中的参考文献)。细胞刺激前，经典NF-κB驻留在细胞质中作为与IκBα抑制蛋白结合的无活性复合物。NF-κB的诱导剂，例如细菌脂多糖、炎性细胞因子或HIV-1Vpr蛋白通过活仳磷酸化IκBα的IκB-激酶复合物(IKK)而从细胞质复合物释放活性NF-κB(Greten和Karin，2004；Hacker和Karin，2006；Israel，2000；Karin，1999；Scheidereit，2006)。IκB的磷酸为随后的泛素化和通过26S蛋白酶体降解提供了标记。游离NF-κB二聚体移位进入核，在核中刺激它们的靶基因转录。
外消旋脱羟基甲基环氧醌霉素(DHMEQ)的分子设计是依据从拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)分离的抗生素环氧醌霉素C(Chaicharoenpong等.2002)。DHMEQ是采用五步骤从2,5-二甲氧基苯胺合成的外消旋物。利用手性柱分离对映体产生(+)和(-)对映体。(-)-对映体显示抑制NF-κB强于(+)-对映体(Umezawa等.2004)。DHMEQ经鉴定为特异性抑制NF-κB移位入核(Ariga等.2002)。具体地说，其以1：1的化学计量比共价修饰p65和其它Rel同源蛋白中的特定半胱氨酸残基(Yammamoto等.2008)。作为NF-κB抑制剂，在各种疾病的动物模型中广泛测试了DHMEQ，证明包括洽疗实体瘤、血液恶性肿瘤、关节炎、肠缺血和动脉粥样硬化在内的广谱效力(Watanabe等.2006)。因此，DHMEQ可用作癌症和炎症的治疗(Takeuchi等.2003)。CN1368954A(中国专利申请号00811487.0)公开了DHMEQ(即其中的DHM2EQ，DHM2EQ和DHMEQ二者在本文中具有相同的含义，可互换使用，在本发明中亦可称为式1化合物或式I化合物)的合成方法，其中在步骤3中，在溶剂四氢呋喃中、在过氧化氢和氢氧化钠的存在下，3-(O-乙酰基水杨酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-环己二烯酮反应生成5,6-环氧-4,4-二甲氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮，反应物需要通过繁杂的处理工艺并且所得产物品质较差。为其后续工艺增加了障碍。
5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮即DHMEQ作为外用药剂用于治疗相关疾病是有益的。由于5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮在水中的溶解性差，因此做成油性基质的软膏剂是有必要的。软膏剂系指原料药物与油脂性或水溶性基质混合制成的均匀的半固体外用制剂。因原料药物在基质中分散状态不同，分为溶液型软膏剂和混悬型软膏剂。溶液型软膏剂为原料药物溶解(或共熔)于基质或基质组分中制成的软膏剂；混悬型软膏剂为原料药物细粉均匀分散于基质中制成的软膏剂。常规软骨含量测定中供试品的制备方法主要是用溶剂直接提取，或是加热后使基质溶解再溶剂提取。DHMEQ软膏是正在研究开发的国家1类新药，该化合物是通过作用于NF-kB信号通路上受体核转录因子(NF-kB)p65蛋白靶点，临床上拟用于治疗特异性皮炎，拟定剂型为软膏。然而这种油性基质的软膏剂在对主成分进行质量控制时存在诸多技术困难。
因此，本领域技术人员还期待有新的方法来对5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮软膏剂的质量进行控制，即提供一种适用的质量分析方法以对5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮软膏剂进行质量控制。此外，本领域技术人员仍然期待有一种具有良好工艺特征的新方法来制备DHMEQ。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种新的方法来对5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮软膏剂的质量进行控制，即提供一种适用的质量分析方法以对5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮软膏剂进行质量控制。此外，本发明另一目的在于提供一种具有良好工艺特征的新方法来制备DHMEQ(即：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮)。本发明人发现本发明方法具有某种或某些优异性质。本发明基于此发现而得以完成。
在本发明的第一方面，示例性的，可以照以下方法来制备以下式1化合物即5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮：
该方法包括以下步骤：
步骤a：使2,5-二甲氧基苯胺溶于有机溶剂(例如吡啶)中，在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，向其中添加以下式(7)的O-烷酰基水杨酰氯的乙酸乙酯溶液，搅拌下使反应进行；然后，加水使反应停止，再加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸、水、碳酸氢钠水溶液和水洗涤后，干燥，减压浓缩，再真空干燥，获得以下式(2)表示的N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺：
其中，R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
步骤b：使以上获得的式(2)的化合物溶于溶剂例如R3OH表示的溶剂中，在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，向其中添加二乙酰氧基碘苯，室温下搅拌使反应进行；然后减压浓缩，在其中添加乙酸乙酯，反应液分别用碳酸氢钠水溶液和食盐水洗涤后，减压浓缩溶剂，对残渣进行精制，获得以下式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮：
其中R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步骤c：使式(3)化合物溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10∶1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(重复萃取2～3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝干燥)，减压浓缩，真空干燥，获得以下式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮：
步骤d：使式(4)化合物溶于溶剂例如二氯甲烷中；在冰冷却下，向其中添加无机酸或有机酸(例如三氟化硼乙醚络合物等)，搅拌下使反应进行；然后在反应液中加入有机溶剂(例如乙酸乙酯)，用水洗涤，将有机层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，获得以下式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮：
步骤e：使式(5)化合物悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加还原剂(例如硼氢化钠)使反应进行；反应完毕后，向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反应液依次用盐酸和水洗涤，对溶剂层进行干燥和减压浓缩，使浓缩物悬浮于甲醇后搅拌洗涤，干燥，获得以下式(1)表示的5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)
根据本发明的第一方面的方法，其包括以下步骤：
步骤a：N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺的制备
使2,5-二甲氧基苯胺溶于有机溶剂(例如吡啶)中，在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，向其中添加式(7)的O-烷酰基水杨酰氯的乙酸乙酯溶液，搅拌下使反应进行；然后，加水使反应停止，再加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸、水、碳酸氢钠水溶液和水洗涤后，干燥，减压浓缩，再真空干燥，获得式(2)表示的N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺；其中R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
步骤b：3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮的制备
使以上获得的式(2)的化合物溶于溶剂例如R3OH表示的溶剂中，在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，向其中添加二乙酰氧基碘苯，室温下搅拌使反应进行；然后减压浓缩，在其中添加乙酸乙酯，反应液分别用碳酸氢钠水溶液和食盐水洗涤后，减压浓缩溶剂，对残渣进行精制，获得式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮；其中R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步骤c：5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的制备
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(重复萃取2～3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝干燥)，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮。
步骤d：5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮的制备
使式(4)的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮溶于溶剂例如二氯甲烷中；在冰冷却下，向其中添加无机酸或有机酸(例如三氟化硼乙醚络合物等)，搅拌下使反应进行；然后在反应液中加入有机溶剂(例如乙酸乙酯)，用水洗涤，将有机层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，获得式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮；
步骤e：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)的制备
使式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加还原剂(例如硼氢化钠)使反应进行；反应完毕后，向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反应液依次用盐酸和水洗涤。然后对溶剂层进行干燥和减压浓缩，使浓缩物悬浮于甲醇后搅拌洗涤，干燥，获得式(1)表示的5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)。
根据本发明的第一方面的方法，其包括以下步骤：
步骤a：N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺的制备
使2,5-二甲氧基苯胺溶于有机溶剂(例如吡啶)中，在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加式(7)的O-烷酰基水杨酰氯的乙酸乙酯溶液，搅拌下使反应进行；然后，加水使反应停止，再加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸、水、碳酸氢钠水溶液和水洗涤后，干燥，减压浓缩，再真空干燥，获得式(2)表示的N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺。不对该化合物进行精制直接将其用于以下步骤；
其中R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
步骤b：3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮的制备
使以上获得的式(2)的化合物溶于溶剂例如R3OH表示的溶剂中，在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加二乙酰氧基碘苯，室温下搅拌使反应进行；然后减压浓缩，在其中添加乙酸乙酯，反应液分别用碳酸氢钠水溶液和食盐水洗涤后，减压浓缩溶剂，用柱色谱法对残渣进行精制，获得式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮；
其中R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步骤c：5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的制备
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝)，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮；
步骤d：5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮的制备
使式(4)的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮溶于溶剂例如二氯甲烷中；在冰冷却下，在其中添加无机酸或有机酸(例如三氟化硼乙醚络合物等)，搅拌下使反应进行；然后在反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯)，用水洗涤，将乙酸乙酯层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，获得式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮；
步骤e：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)的制备
使式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF)中。在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加还原剂(例如硼氢化钠)使反应进行；反应完毕后，向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反应液依次用盐酸和水洗涤。然后对溶剂层进行干燥和减压浓缩，使浓缩物悬浮于甲醇后搅拌洗涤，干燥，获得式(1)表示的5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)。
在本发明的第二方面，示例性的，可以照以下方法来制备以下式1化合物即5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮：
该方法包括以下步骤：
步骤c：使式(3)化合物溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(重复萃取2～3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝干燥)，减压浓缩，真空干燥，获得以下式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮：
其中，R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步骤d：使式(4)化合物溶于溶剂例如二氯甲烷中；在冰冷却下，向其中添加无机酸或有机酸(例如三氟化硼乙醚络合物等)，搅拌下使反应进行；然后在反应液中加入有机溶剂(例如乙酸乙酯)，用水洗涤，将有机层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，获得以下式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮：
步骤e：使式(5)化合物悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加还原剂(例如硼氢化钠)使反应进行；反应完毕后，向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反应液依次用盐酸和水洗涤，对溶剂层进行干燥和减压浓缩，使浓缩物悬浮于甲醇后搅拌洗涤，干燥，获得以下式(1)表示的5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)
根据本发明的第二方面的方法，其包括以下步骤：
步骤c：5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的制备
其中，R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；R3表示C1～4烷基，例如甲基；
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(重复萃取2～3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝干燥)，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮；
步骤d：5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮的制备
使式(4)的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮溶于溶剂例如二氯甲烷中；在冰冷却下，向其中添加无机酸或有机酸(例如三氟化硼乙醚络合物等)，搅拌下使反应进行；然后在反应液中加入有机溶剂(例如乙酸乙酯)，用水洗涤，将有机层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，获得式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮；
步骤e：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)的制备
使式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加还原剂(例如硼氢化钠)使反应进行；反应完毕后，向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反应液依次用盐酸和水洗涤。然后对溶剂层进行干燥和减压浓缩，使浓缩物悬浮于甲醇后搅拌洗涤，干燥，获得式(1)表示的5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)。
根据本发明的第二方面的方法，其包括以下步骤：
步骤c：5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的制备
其中，R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；R3表示C1～4烷基，例如甲基；
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝)，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮；
步骤d：5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮的制备
使式(4)的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮溶于溶剂例如二氯甲烷中；在冰冷却下，在其中添加无机酸或有机酸(例如三氟化硼乙醚络合物等)，搅拌下使反应进行；然后在反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯)，用水洗涤，将乙酸乙酯层浓缩后，所得残渣用甲醇洗涤，获得式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮；
步骤e：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)的制备
使式(5)表示的5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF)中。在-78～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加还原剂(例如硼氢化钠)使反应进行；反应完毕后，向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反应液依次用盐酸和水洗涤。然后对溶剂层进行干燥和减压浓缩，使浓缩物悬浮于甲醇后搅拌洗涤，干燥，获得式(1)表示的5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)。
在本发明的第三方面，示例性的，可以照以下方法来制备以下式4化合物：
该方法包括以下步骤：
使式(3)化合物
溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；
在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，向其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；
然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；
使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(重复萃取2～3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝干燥)，减压浓缩，真空干燥，获得以下式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮：
其中，其中R1表示氢原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
R3表示C1～4烷基，例如甲基。
根据本发明的第三方面的方法，其包括以下步骤：
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；
在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；
然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；
使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取(重复萃取2～3次)，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝干燥)，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮。
根据本发明的第三方面的方法，其包括以下步骤：
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水杨酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-环己二烯酮溶于有机溶剂(例如四氢呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特别是例如二甲基甲酰胺)中；
在-20～50℃的温度下(例如在冰冷却下)，在其中添加过氧化氢水溶液及无机碱(例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠，特别是例如碳酸钠)，搅拌使反应进行；
然后在反应液中加入乙酸乙酯，反应液依次用盐酸溶液、硫代硫酸钠水溶液和食盐水洗涤后干燥，再进行真空干燥；
使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6～10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取3次，弃水层，有机层干燥(例如用芒硝)，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮。
根据本发明的任一方面，其中在制备5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的过程中，过氧化氢的用量是式3化合物即3-(O-乙酰基水杨酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-环己二烯酮用量的8～12倍(摩尔)。相比而言，CN1368954A之实施例3中过氧化氢的用量是式3化合物的16倍(摩尔)，但是其收率以及产物纯度远不及本发明方法，并且其后后处理比本发明方法复杂。
需要说明的是，本发明组合物中使用的原料药DHMEQ可以照本发明方法制备，亦可照其它现有技术方法制备，使用本发明方法制备原料药只是示例性的。
本发明第四方面涉及一种药物组合物，其中包含式1化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、酯、前药、异构体，以及药学上可接受的载体。
根据本发明第四方面的药物组合物，其为软膏剂。
根据本发明第四方面的药物组合物，其为软膏剂，其基质是凡士林。
根据本发明第四方面的药物组合物，其中药物在软膏剂中的含量为0.5～5％，例如药物在软膏剂中的含量为0.5～2.5％，例如药物在软膏剂中的含量为0.5～2％。
进一步的，本发明第五方面提供了一种对本发明第四方面所述药物组合物进行质量控制的方法，该方法包括对所述药物组合物中的活性成分进行含量测定。
根据本发明第五方面的方法，其中对所述药物组合物中的活性成分进行含量测定包括以下步骤：
(1)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.05％(ml/ml)磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为230nm；
(2)供试品溶液的制备：取软膏剂组合物4g，精密称定，置50ml比色管中，精密加入溶剂适量，加玻璃珠适量，充分振摇使DHMEQ溶解，滤过，作为供试品溶液；
(3)对照品溶液的制备：取DHMQ对照品适量，精密称定，加溶剂定量溶解制成每1ml含有DHMEQ为0.2mg的对照品溶液；
(4)测定：分别精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，计算每1g的DHMEQ软膏中的DHMEQ含量。
根据本发明第五方面的方法，其中在制备供试品溶液和对照品溶液时所使用的溶剂是二甲基亚砜溶液。
根据本发明第五方面的方法，其中在制备供试品溶液和对照品溶液时所使用的溶剂是二甲基亚砜溶液，该溶液中含有0.05％的酸。
根据本发明第五方面的方法，其中所述的酸选自：磷酸、硫酸、硝酸、盐酸、氢氟酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸等。已经出人意料地发现，使用三氟乙酸能够获得优异的方法学效果，特别是配制的测试样品具有优异的稳定性。具体地说，在分析例1～3中，供试品溶液在室温下放置5小时后重复测定6次含量，结果供试品中的活性成分显著下降，含量平均值均下降5～7％，例如在分析例1中供试品溶液在室温下放置5小时后重复测定6次含量的平均值为92.2％，RSD为1.1％；在分析例2中供试品溶液在室温下放置5小时后重复测定6次含量的平均值为94.1％，RSD为1.4％；在分析例3中供试品溶液在室温下放置5小时后重复测定6次含量的平均值为93.5％，RSD为1.6％；这表明分析方法中使用磷酸和二甲基亚砜为溶剂配制的供试品溶液不宜过长时间放置。另外，参照分析例1～3，不同的仅是在配制溶剂时向二甲基亚砜中添加的酸为等量的三氟乙酸，结果：分析方法的重复性试验结果分别基本上与分析例1～3相同；分析方法的回收率试验结果分别基本上与分析例1～3相同；使用此三氟乙酸并分别参照分析例1～3的试验中，供试品溶液在室温下放置5小时后重复测定6次含量，结果供试品中的活性成分与未放置5小时而测定的结果基本相同，含量平均值相差均不超过1个百分点，且RSD均小于0.7；可见，使用三氟乙酸和二甲基亚砜为溶剂配制的供试品溶液具有优异的稳定性。补充的试验发现，使用其它酸，例如盐酸、硫酸、乙酸作为溶剂中添加的酸进行试验时，结果与使用磷酸基本类似，供试品溶液的稳定性均不理想。但是完全无法解释的是，在分析例1～3中以及以上使用三氟乙酸的对照试验中，将用添加了磷酸或三氟乙酸的溶剂配制的对照品溶液在室温下放置5小时后进行HPLC测定，峰面积却没有明显的变化，这表明使用同样溶剂配制的对照品溶液却未见这种不稳定性。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
用于描述本发明的术语具有以下意义。本发明的化合物和中间体可按照IUPAC(国际理论和应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务部)命名体系命名。
短语“治疗有效量”指(i)治疗或预防特定疾病、病情或病症，(ii)减弱、缓解或消除特定疾病、病情或病症的一种或多种症状，或(iii)防止或延缓特定疾病、病情的一种或多种症状发作的化合物量。
短语“药学上可接受的”表示指定的载体、运载体、稀释剂、赋形剂和/或盐总体上与构成制剂的其它成分化学和/或物理学相容，并与其受者在生理学上相容。
术语“哺乳动物”指作为分类学哺乳纲成员的各动物，哺乳动物的例子包括但不限于：人、狗、猫、马和牛等。在本发明中，优选的哺乳动物是人。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的式1化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、运载体、稀释剂或赋形剂。优选的本发明药物组合物包含治疗有效量的式1化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、运载体、稀释剂或赋形剂。虽然不难给予各种剂型的通过混合本发明化合物和药学上可接受的载体、运载体或稀释剂形成的药物组合物，例如片剂、粉末剂、锭剂、糖浆、可注射溶液等。如果需要，这些药物组合物含有附加成分，例如调味剂、粘合剂、赋形剂等。
因此，为口服给药，含有各种赋形剂，例如柠檬酸钠、碳酸钙和/或磷酸钙的片剂可与各种崩解剂，例如淀粉、藻酸和/或某些复合硅酸盐以及粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和/或阿拉伯胶一起使用。此外，润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉常用于压片目的。相似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。为此的优选材料包括乳糖和高分子量聚乙二醇。如果需要口服给予酏剂的水性悬液，其中的活性药物试剂可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，和软化剂或悬浮剂(如果需要的话)以及稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇、甘油和/或它们的组合混合。
对于胃肠外给药，可利用芝麻油或花生油、水性丙二醇或无菌水溶液配制的本发明化合物或组合物的溶液。如果需要，可适当缓冲此类水性溶液，含充足盐水或葡萄糖的液体稀释剂首先赋予等渗性。这些特定的水性溶液尤其适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。就此而言，通过本领域技术人员己知的标准技术不难获得所用的无菌水性介质。
在一个示范性实施方式中，药物制剂是单位剂型。在此类剂型中，该制剂再分成单位剂量，其中含有合适量的活性成分。单位剂型可以是包装的制剂，例如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。单位剂型还可以是胶囊、扁囊剂或片剂本身，或者其可以是适当数量的任何这些包装形式。
本领域技术人员己知制备含有一定量活性成分的各种药物组合物的方法。制备药物组合物的方法的例子可参见通过《雷明顿：药学科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy).Lippincott，Williams和Wilkins，第21版.(2005)，其在此全文引用作为参考。
具体实施方式
下面通过具体的实施例/实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
一、原料药合成例部分
实施例1：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)的制备
步骤1：N-(2-乙酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺的合成
使2,5-二甲氧基苯胺(10.0g，65.3mmol)溶于吡啶(100ml)中。在冰冷却下，在其中添加O-乙酰基水杨酰氯(13.0g，65.3mmol)的乙酸乙酯(50ml)溶液，历时15分钟，然后在相同温度下搅拌15分钟。在反应液中加入水(10ml)使反应停止后，添加乙酸乙酯(500ml)，再依次用3当量盐酸(500ml)、水(500ml)、2％碳酸氢钠水溶液(500ml)和水(500ml)洗涤。乙酸乙酯层用芒硝干燥后，减压浓缩并真空干燥，获得呈淡黄色糖浆状的标题化合物(19.8g)。不对该化合物进行精制直接用于以下步骤。经过分离用薄层色谱法精制的标题化合物，其红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例1的数据相同。
步骤2：3-(O-乙酰基水杨酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-环己二烯酮的合成
使步骤1获得的N-(2-乙酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺(19.8g)溶于甲醇(400ml)中。在冰冷却下，在其中添加二乙酰氧基碘苯(27.3g，84.9mmol)，室温搅拌1小时。在减压浓缩反应液而获得的茶色糖浆状残渣中添加乙酸乙酯(1L)，反应液依次用5％碳酸氢钠水溶液(1L)、10％食盐水(1L)洗涤。然后将乙酸乙酯层减压浓缩，用硅胶柱色谱法(1kg，己烷/乙酸乙酯＝2/1)对所得茶色糖浆状残渣进行精制，获得12.6g固状物。将其悬浮于30ml甲醇中，搅拌洗涤，获得10.3g为白色固体的标题化合物，其红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例2的数据相同。
步骤3：5,6-环氧-4,4-二甲氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的合成
使3-(O-乙酰基水杨酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-环己二烯酮(10.9g，33.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(200ml)中；
在冰冷却下，向其中添加264mmol过氧化氢(以30％过氧化氢水溶液形式加入)及1mol/L的碳酸钠(165ml)，在相同温度下搅拌反应2小时；
向反应液中添加乙酸乙酯(500ml)，依次用1当量的盐酸(300ml)、10％硫代硫酸钠水溶液(300ml×2)、10％食盐水(300ml)洗涤后，乙酸乙酯层用芒硝干燥，然后真空干燥，获得呈淡黄色固体粉末；
使干燥所得淡黄色固体粉末溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为10：1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取3次，弃水层，有机层用芒硝干燥，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的白色粉末状的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(本步骤的收率为76％，HPLC纯度为97.3％)。所得式(4)化合物的熔点、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例3的数据相同。
上述HPLC法的色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.12％冰乙酸(90：410)用三乙胺调节pH值至3.0±0.2为流动相；检测波长为225nm。本HPLC法还可用于其它步骤的产物的纯度检测。
在本发明的补充试验中，重复CN1368954A之实施例3的方法，结果：该方法的收率为54％，HPLC纯度为88.7％。
步骤4：5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮的合成
使5,6-环氧-4,4-二甲氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(1.0g，3.27mmol)溶于25ml二氯甲烷中。在冰冷却下，在其中添加三氟化硼乙醚络合物(1ml)，于相同温度下搅拌30分钟。然后，在反应液中添加乙酸乙酯(300ml)，用水(200ml)洗涤。乙酸乙酯层用芒硝干燥后，真空干燥，用甲醇(5ml)对所得茶色固状物进行洗涤，获得呈淡茶色固体的标题化合物(404mg)，其红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例4的数据相同。
步骤5：5,6-环氧-4-羟基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(DHM2EQ)的合成
使5,6-环氧-2-水杨酰氨基-2-环己烯-1,4-二酮(81.8mg，0.316mmol)悬浮于甲醇(10ml)中。在冰冷却下，在其中添加硼氢化钠(11.9mg，0.316mmol)，相同温度下搅拌10分钟。然后，在反应液中加入乙酸乙酯(50ml)，反应液依次用1当量的盐酸(50ml)和水(50ml)洗涤。乙酸乙酯层用芒硝干燥后，减压浓缩，使所得淡茶色固体悬浮于甲醇(1ml)中，搅拌洗涤。获得呈白色固体的DHM2EQ(45.7mg)，其外观及性质、熔点、TLC的Rf值、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例5的数据相同。
实施例2：5,6-环氧-4,4-二甲氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的合成
使3-(O-乙酰基水杨酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-环己二烯酮(10.9g，33.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(200ml)中；在冰冷却下，向其中添加396mmol过氧化氢(以30％过氧化氢水溶液形式加入)及1mol/L的碳酸钠(165ml)，在相同温度下搅拌反应2小时；
向反应液中添加乙酸乙酯(500ml)，依次用1当量的盐酸(300ml)、10％硫代硫酸钠水溶液(300ml×2)、10％食盐水(300ml)洗涤后，乙酸乙酯层用芒硝干燥，然后真空干燥，获得呈淡黄色固体粉末；
使干燥所得淡黄色固体粉末溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为6∶1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取1次，弃水层，有机层用芒硝干燥，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的白色粉末状的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(本步骤的收率为79％，HPLC纯度为96.1％)。所得式(4)化合物的熔点、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例3的数据相同。进一步地，参照实施例1步骤4、步骤5的方法，制备DHM2EQ。
实施例3：5,6-环氧-4,4-二甲氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮的合成
使3-(O-乙酰基水杨酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-环己二烯酮(10.9g，33.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(200ml)中；在冰冷却下，向其中添加330mmol过氧化氢(以30％过氧化氢水溶液形式加入)及1mol/L的碳酸钠(165ml)，在相同温度下搅拌反应2小时；
向反应液中添加乙酸乙酯(500ml)，依次用1当量的盐酸(300ml)、10％硫代硫酸钠水溶液(300ml×2)、10％食盐水(300ml)洗涤后，乙酸乙酯层用芒硝干燥，然后真空干燥，获得呈淡黄色固体粉末；
使干燥所得淡黄色固体粉末溶解于丙酮-石油醚(二者体积比为8∶1)的混合溶剂中，加入等体积的饱和食盐水萃取2次，弃水层，有机层用芒硝干燥，减压浓缩，真空干燥，获得式(4)表示的白色粉末状的5,6-环氧-4,4-二烷氧基-3-水杨酰氨基-2-环己烯酮(本步骤的收率为81％，HPLC纯度为95.8％)。所得式(4)化合物的熔点、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、FAB质谱、和1H-NMR光谱数据CN1368954A之实施例3的数据相同。进一步地，参照实施例1步骤4、步骤5的方法，制备DHM2EQ。
二、组合物制备例部分
组合物例1：
使用实施例1所得DHMEQ为原料药，使用凡士林与其充分混合制备得到药物浓度为1％(w/w)的软膏剂组合物。
组合物例2：
使用实施例2所得DHMEQ为原料药，使用凡士林与其充分混合制备得到药物浓度为0.5％(w/w)的软膏剂组合物。
组合物例3：
使用实施例3所得DHMEQ为原料药，使用凡士林与其充分混合制备得到药物浓度为2.5％(w/w)的软膏剂组合物。
三、质量分析方法(测定软膏剂组合物中活性成分的含量)
分析例1：
使用组合物例1所得软膏剂为测试样品。
1、流动相的制备：乙腈为流动相A，0.05％(ml/ml)磷酸为流动相B，用微孔滤膜滤过。
2、溶剂的制备：取色谱纯的二甲基亚砜1000ml、磷酸0.5g，混匀，用微孔滤膜滤过。
3、对照品溶液的制备：取DHMEQ对照品10mg，精密称定，置于50ml量瓶中，加溶剂定量溶解制成每1ml含有DHMEQ为0.2mg的对照品溶液。
4、供试品溶液的制：取DHMEQ软膏适量(含DHMEQ量相当于10mg)，精密称定，置50ml比色管中，精密加入溶剂适量，加玻璃珠适量，充分振摇使DHMEQ溶解，滤过，作为供试品溶液。
5、供试品中DHMEQ含量的测定：分别精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算每1g的DHMEQ软膏中DHMEQ的量，并与制备软膏剂时理论投料量(药物在软膏剂中的理论浓度)计算活性成分在组合物中的百分含量。
6、重复性试验结果
同法制备6份供试品溶液，按上述方法进行含量测定，结果如下表：
重复性试验结果表
结果表明，重复性试验结果的相对标准偏差(RSD)不大于2.0％，方法的精密度良好。
7、回收率试验结果
以80％、100％、120％浓度水平分别制备各3份供试品溶液，按上述方法进行含量测定，进行回收率的计算。结果如下表：
结果表明，各浓度项下的平均回收率均在98.0％～102.0％，且相对标准偏差(RSD)不大于2.0％，准确度良好。
分析例2：
参照分析例1，对组合物例2所得软膏剂进行质量分析。
在步骤6的重复性试验中，组合物例2软膏剂6次测定含量均在99.4～100.2％范围内，含量平均值为99.7％，RSD为0.3％。
在步骤7的回收率试验中，组合物例2软膏剂三种浓度水平的平均回收率(％)值在99.4～99.6％范围内，RSD为0.4％。
分析例3：
参照分析例1，对组合物例3所得软膏剂进行质量分析。
在步骤6的重复性试验中，组合物例3软膏剂6次测定含量均在99.7～100.5％范围内，含量平均值为100.3％，RSD为0.4％。
在步骤7的回收率试验中，组合物例3软膏剂三种浓度水平的平均回收率(％)值在99.6～99.7％范围内，RSD为0.2％。
无需进一步描述，本领域普通技术人员相信采用以上描述和以下示范性实施例可制备和利用本发明化合物并实施本发明方法。虽然参考各种具体的材料、方法和实施例描述和说明了本发明，但应该知道本发明不限于为该目的而选择的材料和方法的特定组合。本领域技术人员应知道此类细节提示有多种变化。本申请通篇引用的所有专利、专利申请和其它参考文献通过引用全文纳入本文。