一种抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒及其利记博彩app和使用方法与流程

本发明涉及抗增殖细胞核抗原抗体的定量检测，具体涉及一种抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒及其利记博彩app和使用方法。

背景技术：

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)又称Cyclin或DNA聚合酶δ辅助蛋白，是一个36KD的核内蛋白多肽。1978年Myachi等首次发现系统性红斑狼疮患者血清中的自身抗体(抗核抗体)与细胞核增殖状态有密切关系。PCNA在细胞增殖周期中的作用在于：与DNA聚合酶δ结合，从而引导完成DNA的复制。当PCNA缺乏时,在DNA的后随链的模板上只有短的DNA片段合成；当PCNA与DNA聚合酶δ结合时，前导链被合成被合成，从而使得DNA双链能够协调的合成出来。因而DNA聚合酶δ和PCNA可能负责合成前导链。当PCNA的反义寡脱核苷酸作用于细胞时，DNA的合成和细胞的有丝分裂完全被抑制。从而进一步证实了PCNA在细胞DNA合成和细胞周期进展方面的重要作用。

PCNA的表达在细胞增殖周期中的不同阶段是不同的。在静止期和G1早期，PCNA几乎不表达；G1晚期PCNA的表达开始增加；在S期达到高峰，随后在G2期和M期降低。PCNA的发现和其单克隆抗体的建立为研究正常和异常细胞在体内的增殖变化提供了新的研究手段。由于PCNA的表达与DNA的合成有直接的关系，它的存在直接表明细胞处于增殖周期，从而有助于准确了解各种肾脏病的发病过程和进展情况。由于PCNA处在细胞核内，它的免疫组化染色可以与细胞的其它标记物(识别胞浆或胞浆性抗原)的染色接合起来，利用双标记技术可以准确判别处于增殖周期的细胞即PCNA阳性细胞属于那种细胞类型，从而有助于分析各种细胞在肾脏病进展中的作用。

但是目前对于增殖细胞核抗原定量检测依然没有快速有效的方法。

技术实现要素：

针对以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒及其利记博彩app和使用方法，以解决现有技术中增殖细胞核抗原定量检测的难题。抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒用纯化的抗体包被酶标板，制成固相载体，往包被抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)抗体的酶标板中依次加入标本或标准品、生物素化的抗PCNA抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素，经过洗涤液彻底洗涤后用底物溶液显色。四甲基联苯胺(TMB)在过辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在终止液的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的增殖细胞核抗原(PCNA)呈正相关。用酶标仪测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。具体技术方案如下：

一种抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒，其固相载体为纯化的抗体包被的酶标板。

进一步地，所述纯化的抗体为抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)抗体。

进一步地，还包括标准品、样品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、底物溶液、浓洗涤液以及终止液。

进一步地，所述标准品为粉末状固体或溶液状态。

进一步地，所述标准品为溶液形式，其浓度分别为0ug/L，0.03ug/L，0.06ug/L，0.12ug/L，0.24ug/L，0.48ug/L。

进一步地，所述终止液为HCl或H2SO4。

进一步地，所述底物溶液包含第一底物溶液和第二底物溶液，所述第一底物溶液为过氧化氢，所述第二底物溶液为四甲基联苯胺(TMB)。

上述抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒的利记博彩app，用纯化的抗体包被酶标板，制成固相载体；往包被抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)抗体的酶标板中依次加入标本或标准品、生物素化的抗PCNA抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素。

上述抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)配置标准液；

(2)加样；

(3)弃去液体并甩干，加工作液；

(4)温育后，弃去孔内液体，甩干；

(5)每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液；

(6)温育后，弃去孔内液体，甩干；

(7)依序每孔加底物溶液；

(8)依序每孔加终止溶液；

(9)酶联仪测量；或者进一步包括：

(10)绘制标准曲线。

进一步地，步骤(1)之前提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡；和/或，步骤(1)中，用样品稀释液溶解标准品，浓度配成0.48ug/L、0.24ug/L、0.12ug/L、0.06ug/L、0.03ug/L、0ug/L，其中0ug/L为不含标准品的样品稀释液；和/或，步骤(2)中，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，加样将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟；和/或，步骤(3)中，每孔加生物素标记抗体工作液100ul，37℃,60分钟；和/或，步骤(4)中，温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干；和/或，步骤(5)中，每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100ul，37℃，60分钟；和/或，步骤(6)中，温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干；和/或，步骤(7)中，依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色；和/或，步骤(8)中，依序每孔加终止溶液50ul，终止反应；和/或，步骤(9)中，用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度，在加终止液后15分钟以内进行检测；和/或，步骤(10)中，绘制标准曲线，并将样品反应后的吸光度与标准曲线对比，确定样品浓度，并乘以稀释倍数，既得到原样品浓度。

与目前现有技术相比，本发明酶联免疫法测定增殖细胞核抗原(PCNA)能为广大客户接受，操作简单，而且标准品采用粉末固体，客户使用前才进行配置，虽然增加用户的操作步骤，但是浓度准确，不会出现活性降解的情况。本发明的检测试剂盒使用方便、检测方法高效、准确、简便，适合大批量样品定性或定量。具体来说：使用酶联免疫作为比较经典的生物样品检测方法，酶联免疫法测定增殖细胞核抗原(PCNA)能为广大客户接受，操作简单，而且标准品采用粉末固体，客户使用前才进行配置，虽然增加用户的操作步骤，但是浓度准确，不会出现活性降解的情况。本发明的检测试剂盒使用方便、检测方法高效、准确、简便，适合大批量样品定性或定量。

附图说明

为抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体标准品标准曲线图

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

在一个优选实施例中，一种抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒，所述试剂盒的反应原理为：用纯化的抗体包被酶标板，制成固相载体，往包被抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)抗体的酶标板中依次加入标本或标准品、生物素化的抗PCNA抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素，经过洗涤液彻底洗涤后用底物溶液显色。四甲基联苯胺(TMB)在过辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在终止液的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的增殖细胞核抗原(PCNA)呈正相关。用酶标仪测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

试剂盒包含酶标板、标准品、样品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、底物溶液、浓洗涤液、终止液。所述标准品为粉末状固体或溶液状态，如果为溶液形式，其浓度分别为0ug/L，0.03ug/L，0.06ug/L，0.12ug/L，0.24ug/L，0.48ug/L。优选粉末固体。所述终止液为HCl或H2SO4，优选H2SO4，更优选H2SO4浓度为4M。所述底物溶液包含底物溶液1和底物溶液2，所述底物溶液1为过氧化氢，所述底物溶液2为四甲基联苯胺(TMB)。所述酶标仪测定吸光度时使用波长为400～550nm，优选波长450nm。

在另一个优选实施例中，一种抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体定量试剂盒，进一步地试剂盒包含酶标板、标准品、样品稀释液、生物素标记抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液、生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、底物溶液、浓洗涤液、终止液。

所述标准品为粉末状固体或溶液状态，如果为溶液形式，其浓度分别为0ug/L，0.03ug/L，0.06ug/L，0.12ug/L，0.24ug/L，0.48ug/L。优选粉末固体。

所述终止液为HCl或H2SO4，优选H2SO4，更优选H2SO4浓度为4M。所述底物溶液包含底物溶液1和底物溶液2，所述底物溶液1为过氧化氢，所述底物溶液2为四甲基联苯胺(TMB)。

所述试剂盒的反应原理为：用纯化的抗体包被酶标板，制成固相载体，往包被抗增殖细胞核抗原抗体(PCNA)抗体的酶标板中依次加入标本或标准品、生物素化的抗PCNA抗体、辣根过氧化物酶标记的亲和素，经过洗涤液彻底洗涤后用底物溶液显色。四甲基联苯胺(TMB)在过辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在终止液的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的增殖细胞核抗原(PCNA)呈正相关。用酶标仪测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

所述酶标仪测定吸光度时选择波长为400～550nm，优选波长450nm。

具体的使用方法采用如下步骤：

实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1、配置标准液：用样品稀释液溶解标准品，浓度配成0.48ug/L、0.24ug/L、0.12ug/L、0.06ug/L、0.03ug/L、0ug/L，其中0ug/L为不含标准品的样品稀释液。

2、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

3、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100ul(取1ul生物素标记抗体加99ul生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37℃,60分钟。

4、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。

5、每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液)100ul，37℃，60分钟。

6、温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。

7、依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。

8、依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

9、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。

10、绘制标准曲线，并将样品反应后的吸光度与标准曲线对比，确定样品浓度。并乘以稀释倍数，既得到原样品浓度。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。