利用HPLC测定盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质的方法与流程

本发明属于药物分析
技术领域：
，具体而言，本发明涉及一种利用hplc(高效液相色谱法)测定盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质的方法。
背景技术：
：盐酸阿考替胺(acotiamidehydrochloridehydrate)是全球首个功能性消化不良(functionaldyspepsia，fd)治疗药，是由日本安斯泰来制药公司和日本泽里新药株式会社联合开发的一种新型的促进胃蠕动的毒蕈碱m1和m2受体阻断剂，其在消化道主要是通过抑制乙酰胆碱酯酶的机制起作用，可促进胃动力、改善胃容纳障碍、增强胃底扩张。盐酸阿考替胺口服片剂(商品名为acofide，规格为100mg)，于2013年6月6日在日本被批准用于治疗功能性消化不良，临床上用于餐后饱胀、上腹胀痛、早期腹胀等功能性消化不良疾病的治疗，具有良好的疗效，无耐药性并显示高安全性。与一般促胃肠动力药(伊托必利、莫沙比利)不同，盐酸阿考替胺能够通过促进肠内胆碱神经末梢乙酰胆碱的释放来提高胃肠蠕动而改善受损的胃动力与滞后的胃的排空，为第一个胃肠蠕动改善药物。然而，目前分析盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质的方法仍有待改进。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种快速分析分离盐酸阿考替胺降解产物、工艺副反应杂质和中间体的高效液相色谱法，从而实现了盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质在同一色谱条件下的分离测定。盐酸阿考替胺的化学名称为n-[2-(二异丙基氨基)乙基]-2-[(2-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)氨基]-1,3-噻唑-4-羧酰胺的盐酸盐三水化合物，其结构式为：盐酸阿考替胺合成采用路线：盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质有以下三个来源：一为本品合成过程中带入的原料、中间体、降解产物；二为合成反应中生成的副产物；三为贮存过程中由于环境的影响产生的降解产物，主要有：杂质1为原料：(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基-1-氧代戊基]-4-苯基-2-噁唑烷酮；杂质2为原料：2-氨基噻唑-4-甲酸甲酯；杂质3为中间体：(s)-3-((2r,5r)-5-(4-氟苯基)-2-((s)-(4-氟苯基氨基)(4-羟基苯基)甲基)-5-羟基苯基)-4-苯基-2-噁唑烷酮；杂质4为副反应产物：2-(2,4,5-三甲氧基-苯甲酰胺基)-噻唑-4-羧酸-(2-二异丙基氨基-乙基)-酰胺；杂质5为副反应产物、降解产物：n-[2-(二异丙基氨基)乙基]-2-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酰胺；杂质6为副反应产物、降解产物：2-氨基-n-[2-(二异丙基氨基)乙基]噻唑-4-羧酰胺；杂质7为副反应产物、降解产物：2-[(2-羟基-4,5-二甲氧基苯甲酰基)氨基]-1,3-噻唑-4-羧酸。对于合成、生产、贮存盐酸阿考替胺原料药及制备、贮存盐酸阿考替胺制剂的过程中都可能产生的以上杂质，均需进行严格控制，以保证产品质量。因此，实现盐酸阿考替胺及其制剂中有关物质的快速分离和分析在合成和制剂过程的质量控制方面都具有重要的现实意义。在本发明的一个方面，本发明提供了一种利用hplc测定盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质的方法。所述方法的色谱条件为：色谱柱为辛烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为磷酸盐缓冲液与第一有机溶剂的混合溶液。由此，可以将盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质在同一色谱条件下进行快速高效的分离，可有效控制原料药和制剂的质量。该检测方法灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、操作方便，可有效控制产品的质量。根据本发明实施例的测定盐酸阿考替胺原料药及其制剂中有关物质的方法，还可以具有以下附加技术特征：根据本发明的实施例，梯度洗脱的条件为：0分钟时，所述磷酸盐缓冲液与所述第一有机溶剂的体积比为85％:15％；20分钟时，所述磷酸盐缓冲液与所述第一有机溶剂的体积比为65％:35％；25-30分钟时，所述磷酸盐缓冲液与所述第一有机溶剂的体积比为50％:50％；30.01－35分钟时，所述磷酸盐缓冲液与所述第一有机溶剂的体积比为(50－85)％:(50－15)％；由此得到的分离效果最佳，峰形最好。根据本发明的实施例，所述梯度洗脱的条件为：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515根据本发明的实施例，所述磷酸盐缓冲液为选自磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液中的至少一种，优选为磷酸二氢钾缓冲液或磷酸二氢钠缓冲液，最优选为磷酸二氢钾缓冲液。由此，可以进一步改善色谱峰的峰形。根据本发明的实施例，所述磷酸盐缓冲液中含有0.1体积％～0.3体积％的二乙胺，优选含有0.2体积％的二乙胺。由此，可以进一步改善色谱峰的峰形。根据本发明的实施例，所述磷酸盐缓冲液的ph值为5.0～6.0，优选为6.0。根据本发明的实施例，采用磷酸调节所述磷酸盐缓冲液的ph值至5.0～6.0。由此，可以进一步改善主峰与杂质峰之间的分离度，降低主峰的拖尾因子，提高主峰的理论塔板数。根据本发明的实施例，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.001mol/l～0.10mol/l，优选为0.01mol/l～0.05mol/l，最优选为0.02mol/l。由此，可以在保证分离效果的情况下将对仪器和色谱柱的损害减小至最低。根据本发明的实施例，所述第一有机溶剂为甲醇和/或乙腈，优选为乙腈。由此，可以进一步提高分离效率。根据本发明的实施例，本发明的分析方法包括：采用第二有机溶剂和水的混合溶液将待检测样品配制成样品溶液，将样品溶液注入高效液相色谱仪，完成盐酸阿考替胺及制剂中有关物质的测定。根据本发明的实施例，所述第二有机溶剂为甲醇和/或乙腈，优选为乙腈。根据本发明的实施例，所述第二有机溶剂和水的混合比为(80体积％：20体积％)～(20体积％：80体积％)，优选为30体积％：70体积％。根据本发明的实施例，注入高效液相色谱仪的样品溶液为2～20μl，优选为10μl。根据本发明的实施例，高效液相色谱仪的检测波长为215nm～225nm，优选为220nm。由此，可以显著提高检测灵敏度。根据本发明的实施例，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。由此，可以进一步提高分离度。根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃，优选为30℃。由此，可以显著改善相邻色谱峰之间的分离度。根据本发明的实施例，所述制剂包括药学上可接受的给药剂型，任选地，所述制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂。根据本发明的具体实施例，测定盐酸阿考替胺及其制剂中有关物质的方法，可以依照以下步骤实现：取盐酸阿考替胺原料药约25mg或盐酸阿考替胺制剂适量(约相当于盐酸阿考替胺25mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈-水(30:70)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每1ml中约含盐酸阿考替胺0.5g的溶液，作为供试品溶液；精密量取0.1ml，置100ml量瓶中，用乙腈-水(30:70)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。依照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)试验，用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液为流动相a，以第一有机溶剂为流动相b；流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min；柱温25℃～35℃，优选为30℃；检测波长为220nm。精密量取对照溶液与供试品溶液各2～20μl，优选为10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法或不加校正因子的主成分自身对照法或外标法计算盐酸阿考替胺中有关物质的含量。本发明的所述方法可将盐酸阿考替胺及其制剂中有关物质各成分分离彻底，主峰前后杂质峰与主峰分离度良好，可操作性强，分析方法专属性强、检测灵敏度高、精密度高、准确性强、操作方便，可有效控制原料药及其制剂的质量。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明图1显示了根据本发明实施例1，系统适用性溶液检测的高效液相色谱图；图2显示了根据本发明实施例2，盐酸阿考替胺原料药的0.1％对照溶液的高效液相色谱图；图3显示了根据本发明实施例2，盐酸阿考替胺原料药的供试品溶液的高效液相色谱图；图4显示了根据本发明实施例4，系统适用性溶液检测的高效液相色谱图；图5显示了根据本发明实施例5，系统适用性溶液检测的高效液相色谱图；图6显示了根据本发明实施例6，系统适用性溶液检测的高效液相色谱图。具体实施方式提供以下实施例以进一步举例说明本发明及其实施方式。在实施例中给出的具体详细内容仅是出于举例说明的目的，而不是应将其解释为限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本发明实施例中所用的盐酸阿考替胺原料药为申请人按上述合成路线自制。所用的盐酸阿考替胺制剂为申请人所在单位自制。盐酸阿考替胺对照品(自制，批号：rs-aco20140501)盐酸阿考替胺原料药(自制，批号：ws0267-075-01)盐酸阿考替胺片(自制，规格：100mg，批号：20140526)实施例1仪器：agilent1260高效液相色谱仪，1260infinity二极管阵列检测器色谱柱：hypersilbdsc8(250*4.6mm，5μm)流动相a：0.02mol/l磷酸二氢钾缓冲液(含0.2体积％三乙胺，用浓磷酸调ph至6.0)流动相b：乙腈梯度洗脱见下表：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515流速：1.0ml/min检测波长：220nm柱温：30℃进样体积：10μl溶剂：乙腈-水(30:70)运行时间：35分钟1、色谱条件的确定采用紫外-可见分光光度计对盐酸阿考替胺及其所含杂质1～杂质7在200～400nm之间进行了紫外光谱扫描，结果显示阿考替胺和各杂质均在220nm波长下有较强吸收，故选择220nm作为检测波长。2、方法学专属性空白溶液：乙腈-水(30:70)系统适用性溶液：分别精密称取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7各约10mg置同一20ml容量瓶中，加乙腈-水(30:70)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为溶液a。精密称取盐酸阿考替胺对照品约10mg，置20ml容量瓶中，精密移取0.2ml溶液a于该量瓶中，加乙腈-水(30:70)稀释至刻度，摇匀。精密量取空白溶液、系统适用性溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果显示，空白溶液对各峰检测无干扰。系统适用性溶液(见图1)中保留时间为4.242min、5.472min、8.564min、11.106min、13.998min、18.668min、19.153min、33.013min的色谱峰依次为杂质6、杂质2、杂质7、杂质5、阿考替胺、杂质4、杂质3和杂质1的色谱峰，其中阿考替胺与杂质4的分离度为21.55，杂质3与杂质4的分离度为2.23，阿考替胺峰的拖尾因子为1.17，理论塔板数为85007。结果表明，该分析方法的专属性强。3、检测限和定量限取盐酸阿考替胺、杂质1～杂质7对照品适量，加乙腈-水(30:70)溶解并逐级稀释，精密量取待测溶液10μl，注入液相色谱仪，记录峰高，取信噪比为10的浓度作为定量限，取信噪比为3的浓度作为检测限。测定结果为：盐酸阿考替胺的检测限为0.03μg/ml，定量限为0.1μg/ml；杂质1的检测限为0.06μg/ml，定量限为0.2μg/ml；杂质2的检测限为0.06μg/ml，定量限为0.2μg/ml；杂质3的检测限为0.03μg/ml，定量限为0.1μg/ml；杂质4的检测限为0.06μg/ml，定量限为0.2μg/ml；杂质5的检测限为0.06μg/ml，定量限为0.2μg/ml；杂质6的检测限为0.06μg/ml，定量限为0.2μg/ml；杂质7的检测限为0.03μg/ml，定量限为0.1μg/ml。结果表明，该分析方法的检测灵敏度高。4、精密度试验(重复性试验)精密称取盐酸阿考替胺原料药约25mg，置50ml量瓶中，加乙腈-水(30:70)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行配制6份)。精密量取6份供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定主峰面积归一化含量，记录色谱图，结果见表1。从表1可以看出，重复性测定结果的rsd为0.01％，说明本有关物质的检测方法的重复性良好。表1重复性试验结果供试品溶液123456平均值rsd(％)主峰面积归一化含量99.9499.9499.9499.9399.9399.9499.940.01实施例2仪器：agilent1260高效液相色谱仪，1260infinity二极管阵列检测器色谱柱：hypersilbdsc8(250*4.6mm，5μm)流动相a：0.02mol/l磷酸二氢钾缓冲液(含0.2体积％三乙胺，用浓磷酸调ph至6.0)流动相b：乙腈梯度洗脱见下表：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515流速：1.0ml/min检测波长：220nm柱温：30℃进样体积：10μl溶剂：乙腈-水(30:70)运行时间：35分钟实验步骤：供试品溶液：精密称取盐酸阿考替胺原料药约25mg，置50ml量瓶中，加乙腈-水(30:70)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀。0.1％对照溶液：精密量取供试品溶液0.1ml，置100ml量瓶中，用乙腈-水(30:70)稀释至刻度，摇匀。精密量取0.1％对照溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，具体见图2～图3。采用主成分自身对照法计算盐酸阿考替胺原料药中各杂质的含量，结果显示杂质1～杂质7均未检出，其他单个杂质均≤0.1％，总杂质≤0.5％，原料药的有关物质检测结果符合质量标准。实施例3仪器：agilent1260高效液相色谱仪，1260infinity二极管阵列检测器色谱柱：hypersilbdsc8(250*4.6mm，5μm)流动相a：0.02mol/l磷酸二氢钾缓冲液(含0.2体积％三乙胺，用浓磷酸调ph至6.0)流动相b：乙腈梯度洗脱见下表：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515流速：1.0ml/min检测波长：220nm柱温：30℃进样体积：10μl溶剂：乙腈-水(30:70)运行时间：35分钟实验步骤：供试品溶液：精密称取盐酸阿考替胺片细粉适量(相当于盐酸阿考替胺约25mg)，置50ml量瓶中，加乙腈-水(30:70)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀。0.1％对照溶液：精密量取供试品溶液0.1ml，置100ml量瓶中，用乙腈-水(30:70)稀释至刻度，摇匀。精密量取0.1％对照溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。采用主成分自身对照法计算盐酸阿考替胺片中各杂质的含量，结果显示杂质1～杂质7均未检出，其他单个杂质均≤0.1％，总杂质≤0.5％，原料药的有关物质检测结果符合质量标准。实施例4仪器：agilent1260高效液相色谱仪，1260infinity二极管阵列检测器色谱柱：hypersilbdsc8(250*4.6mm，5μm)流动相a：0.05mol/l磷酸二氢钾缓冲液(含0.3％三乙胺，用浓磷酸调ph至5.5)流动相b：乙腈梯度洗脱见下表：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515流速：1.0ml/min检测波长：220nm柱温：30℃进样体积：10μl溶剂：乙腈-水(20:80)运行时间：35分钟实验步骤：系统适用性溶液：分别精密称取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7各约10mg置同一20ml容量瓶中，加乙腈-水(20:80)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为溶液a。精密称取盐酸阿考替胺对照品约10mg，置20ml容量瓶中，精密移取0.2ml溶液a于该量瓶中，加乙腈-水(20:80)稀释至刻度，摇匀。取系统适用性溶液10μl，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。系统适用性溶液(见图4)中保留时间为4.183min、5.468min、9.179min、11.035min、16.077min、18.158min、21.562min、32.938min的色谱峰依次为杂质6、杂质2、杂质7、杂质5、阿考替胺、杂质4、杂质3和杂质1的色谱峰，其中阿考替胺与杂质4的分离度为9.50，阿考替胺峰的拖尾因子为1.44，理论塔板数为81754。结果表明盐酸阿考替胺中有关物质可以在同一色谱条件下达到良好的分离。实施例5仪器：agilent1260高效液相色谱仪，1260infinity二极管阵列检测器色谱柱：hypersilbdsc8(250*4.6mm，5μm)流动相a：0.01mol/l磷酸二氢钾缓冲液(含0.1体积％三乙胺，用浓磷酸调ph至5.0)流动相b：乙腈梯度洗脱见下表：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515流速：1.0ml/min检测波长：220nm柱温：30℃进样体积：10μl溶剂：乙腈-水(80:20)运行时间：35分钟实验步骤：系统适用性溶液：分别精密称取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7各约10mg置同一20ml容量瓶中，加乙腈-水(80:20)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为溶液a。精密称取盐酸阿考替胺对照品约10mg，置20ml容量瓶中，精密移取0.2ml溶液a于该量瓶中，加乙腈-水(80:20)稀释至刻度，摇匀。取系统适用性溶液10μl，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。系统适用性溶液(见图5)中保留时间为4.168min、5.456min、9.866min、11.053min、17.320min、17.960min、22.940min、32.943min的色谱峰依次为杂质6、杂质2、杂质7、杂质5、阿考替胺、杂质4、杂质3和杂质1的色谱峰，其中阿考替胺与杂质4的分离度为2.54，阿考替胺峰的拖尾因子为1.66，理论塔板数为76344。结果表明盐酸阿考替胺中有关物质可以在同一色谱条件下达到良好的分离。实施例6仪器：agilent1260高效液相色谱仪，1260infinity二极管阵列检测器色谱柱：hypersilbdsc8(250*4.6mm，5μm)流动相a：0.02mol/l磷酸二氢钾缓冲液(含0.2体积％三乙胺，用浓磷酸调ph至4.0)流动相b：乙腈梯度洗脱见下表：时间/min磷酸盐缓冲液/％第一有机溶剂/％0851520653525505030505030.018515358515流速：1.0ml/min检测波长：220nm柱温：30℃进样体积：10μl溶剂：乙腈-水(30:70)运行时间：35分钟实验步骤：系统适用性溶液：分别精密称取杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7各约10mg置同一20ml容量瓶中，加乙腈-水(30:70)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为溶液a。精密称取盐酸阿考替胺对照品约10mg，置20ml容量瓶中，精密移取0.2ml溶液a于该量瓶中，加乙腈-水(30:70)稀释至刻度，摇匀。取系统适用性溶液10μl，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。系统适用性溶液(见图6)中保留时间为4.098min、5.051min、11.066min、16.749min、18.038min、23.658min、33.018min的色谱峰依次为杂质6、杂质2、杂质5、杂质7、阿考替胺(含杂质4)、杂质3和杂质1的色谱峰，其中阿考替胺与杂质7的分离度为5.40，阿考替胺与杂质4未分离，阿考替胺峰的拖尾因子为1.86，理论塔板数为68779。结果表明色谱条件与实施例1条件类似，仅改变磷酸盐缓冲液ph值为4.0时，盐酸阿考替胺中有关物质不能在同一色谱条件下达到良好的分离。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12