本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒。
背景技术：
：宫颈癌是在女性中第二常见的癌症诊断，并且在99.7％的情况下与高危人乳头瘤病毒感染相关，全世界每年有约400000例宫颈癌，近200000人死亡。HPV有超过100种不同的分离株，已根据它们与宫颈癌或与良性宫颈病变或非典型增生的关联性被宽泛地再分成高危和低危亚型。低危险型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI)，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，CP8304等亚型，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型，其中HPV16占50％以上。人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，共有3个基因区组成，包括早期区(EarlyRegion，E区)、晚期区(LateRegion，L区)与非编码区(UncodingRegion，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。E6和E7蛋白使肿瘤阻抑蛋白p53和pRB钝化，分别解除细胞周期控制和抑制细胞凋亡。因此，用于测定肿瘤中的HPV状态的最佳方法是测量肿瘤细胞中的E6/E7蛋白。目前人乳头瘤病毒(HPV)的主要检测方法包括原位杂交，DNA直接捕捉法和各类PCR方法。上世纪90年代中期在传统的PCR基础上发展起来的实时荧光定量PCR(qPCR,Real-timeQuantitativePCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子诊断研究中的重要工具。但是上述方法只是在基因水平上检测是否感染了人乳头瘤病毒(HPV)，至于相关致癌蛋白的表达与否，实时荧光定量PCR技术并不能给出准确的判断，而且该方法需要配套仪器实时荧光定量PCR仪，价格昂贵，检测成本高。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了用于检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)16亚型E7致癌蛋白的化学发光检测试剂盒。宫颈脱落细胞裂解后直接加样，直接检测高危型HPV相关致癌蛋白的表达与否以及表达量，从而对于高危型HPV的感染程度有了明确的判断，方便了后续的治疗。这一点恰恰正是目前检测方法(包括实时荧光定量PCR技术)不能媲美的。本发明试剂盒采用双抗体夹心法，使用抗体检测人体宫颈脱落细胞中的高危型HPV16型E7蛋白。先将宫颈脱落细胞裂解后，直接加入包被了特异性抗体的化学发光板中，经温育和洗涤后，加入酶标抗体，再经温育和洗涤后加入底物，用化学发光仪检测发光值。发光值与E7蛋白含量呈正相关，由此实现对人体宫颈脱落细胞中的HPV16型E7蛋白的定量检测。本发明采用的技术方案为：本发明提供了一种HPV16型E7蛋白检测的化学发光板，该化学发光板包被有HPV16型E7抗体。优选地，该化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg。优选地，所述化学发光板的制备方法，包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h进行封闭；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。本发明还提供了一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg；HRP标记的HPV16型E7抗体：浓度为0.05～0.4μg/ml。进一步，所述的试剂盒还包括人体宫颈脱落细胞裂解液。优选地，所述的人体宫颈脱落细胞裂解液包括：0.05％～1％(体积百分比)表面活性剂；10mM～1M缓冲液；1mM～10mM蛋白酶抑制剂。(结合多次冻融可达到更加理想的裂解效果)更优选地，所述的表面活性剂为Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸钠中的一种或两种以上。所述的缓冲液为phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为cystatin，PMSF或Antipain中的一种或两种以上。更优选地，所述的人体宫颈脱落细胞裂解液由包括如下步骤的方法制备得到：用10mM～1M缓冲液配置0.05％～1％(体积百分比)表面活性剂；用之前加入终浓度为1mM～10mM蛋白酶抑制剂。更优选地，所述的人体宫颈脱落细胞裂解液由包括如下步骤的方法制备得到：用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入终浓度为5mM蛋白酶抑制剂PMSF。进一步，所述的包被有HPV16型E7抗体的化学发光板的制备方法，包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h进行封闭；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。具体地，该试剂盒的主要组成成分如下：①上述包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg，条形微孔板(12条×8孔)，置于框架中；②HPV16型E7蛋白校准品0、1、2、3、4、5：校准品为冻干粉，分别加入1mlddH2O溶解，校准品溶液的线性浓度分别为0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白质控品1、2：质控品为冻干粉，加入1mlddH2O溶解，浓度分别为10和80ng/ml；④HRP标记的HPV16型E7抗体：直接使用，浓度为0.05～0.4μg/ml，1瓶，每瓶12ml；⑤上述人体宫颈脱落细胞裂解液；⑥底物溶液：如可以选择湖州英创生物科技有限公司的化学发光底物液(包括底物A液和B液)⑦浓缩洗涤液(20×)：含有去污剂和防腐剂的浓缩洗涤液，用ddH2O稀释20倍；⑧封口膜：孵育时密封微孔板的粘性薄膜。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：①制备包被HPV16型E7抗体的化学发光板取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L，37℃放置1～2h进行封闭；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。②标准品、质控品HPV16型E7蛋白校准品0、1、2、3、4、5：校准品为冻干粉，分别加入1mlddH2O溶解，校准品溶液的线性浓度分别为0、10、20、40、80、160ng/ml；HPV16型E7蛋白质控品1、2：质控品为冻干粉，加入1mlddH2O溶解，浓度分别为10和80ng/ml；③HRP标记的HPV16型E7抗体采用过碘酸钠法进行标记，之后加入HRP稳定剂，混匀，浓度为0.05～0.4μg/ml，2-8℃保存。④人体宫颈脱落细胞裂解液用10mM～1M缓冲液配置0.05％～1％(体积百分比)表面活性剂；用之前加入终浓度为1mM～10mM蛋白酶抑制剂。所述的表面活性剂为Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸钠中的一种或两种以上。所述的缓冲液为phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为cystatin，PMSF或Antipain中的一种或两种以上。⑤浓缩洗涤液(20×)28.8gNa2HPO4·12H2O、4.8gKH2PO4、160gNaCl、4gKCl、10mlTween-20、6mlproclin300加入ddH2O，定容至1000ml，混匀，室温保存。⑥底物溶液、封口膜，均为市售产品，直接购买得到。该试剂盒的检测方法，包括如下步骤：获取足量的人体宫颈脱落细胞，加入裂解液中，涡旋震荡2～10min，放入-20℃冰箱冻融1～3次，再次震荡2～10min，离心10～30min(13000rpm)，收集上清，直接进行检测；①从4℃冰箱取出所需化学发光包被板，室温放置15min；②每孔加入100ul校准品/质控品/样本，混匀置于37℃孵育30～60min；③甩干孔内液体，每孔加入300μl洗涤液，静置孵育1min，甩干孔内液体，在吸水纸上拍干，如此重复3～5次；④每孔加入100μl酶标抗体溶液，置于37℃孵育30～60min；⑤甩干孔内液体，每孔加入300μl洗涤液，静置孵育1min，甩干孔内液体，在吸水纸上拍干，如此重复3～5次；⑥每孔加入50ul化学发光底物A液和50ul化学发光底物B液(湖州英创生物科技有限公司)，置于化学发光检测仪读取发光值；以校准品浓度为横坐标，发光值为纵坐标，采用四参数逻辑拟合法得到标准曲线方程，根据标准曲线方程计算待检样本中HPV16型E7蛋白含量。试剂盒的结果判读本发明所具有的有益效果:某些临床病人虽然基因水平上感染了人乳头瘤病毒(HPV)，但是相关致癌蛋白表达量很低甚至不表达，这种情况可通过病人自身的免疫系统消除人乳头瘤病毒(HPV)，无需引起恐慌以及不必要的治疗，减轻患者精神压力以及经济压力。基于此，本发明直接检测高危型HPV相关致癌蛋白的表达与否以及表达量，从而对于高危型HPV的感染程度有了明确的判断，方便了后续的治疗。该发明与目前基因水平检测方法形成互补，使得检测结果愈加精确，治疗方案愈加明确，患者早日康复。同时该方法只需要常规的化学发光仪，检测成本低，可作为宫颈癌筛查的首选方法。附图说明图1是实施例4以校准品浓度为横坐标，发光值为纵坐标，采用四参数逻辑拟合法得到标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。实施例1、包被HPV16型E7抗体的化学发光板的制备方法，包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液为：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置2h进行封闭；在干燥房(26℃)抽干后，真空密封(4℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。实施例2、配置人体宫颈脱落细胞裂解液以及裂解宫颈样本用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入终浓度为5mM蛋白酶抑制剂PMSF。将500ul裂解液加入宫颈脱落细胞收集管中，涡旋震荡2min，置于-20℃冰箱10min，之后置于37℃烘箱2min，再次震荡，离心(20min，13000rpm，4℃)，收集上清进行检测。实施例3一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒的制备方法，①包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：每个微孔内抗体的包被量为0.5μg，条形微孔板(12条×8孔)，置于框架中；制备方法同实施例1。②HPV16型E7蛋白校准品0、1、2、3、4、5：校准品为冻干粉，分别加入1mlddH2O溶解，校准品溶液的线性浓度分别为0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白质控品1、2：质控品为冻干粉，加入1mlddH2O溶解，浓度分别为10和80ng/ml；④HRP标记的HPV16型E7抗体：采用过碘酸钠法进行标记，之后加入HRP稳定剂，混匀，2-8℃保存，浓度为0.4μg/ml，1瓶，每瓶12ml；⑤人体宫颈脱落细胞裂解液；制备方法同实施例2。⑥底物溶液：化学发光底物A液和B液；(湖州英创生物科技有限公司)⑦浓缩洗涤液(20×)：28.8gNa2HPO4·12H2O、4.8gKH2PO4、160gNaCl、4gKCl、10mlTween-20、6mlproclin300加入ddH2O，定容至1000ml，混匀，室温保存。⑧封口膜：孵育时密封微孔板的粘性薄膜。实施例4、检测某一宫颈样本化学发光板的包被以及宫颈样本的裂解同实施例1～2。①从4℃冰箱取出所需化学发光包被板，室温放置15min；②每孔加入100ul校准品/质控品/样本，混匀置于37℃孵育60min；③甩干孔内液体，每孔加入300μl洗涤液，静置孵育1min，甩干孔内液体，在吸水纸上拍干，如此重复5次；④每孔加入100μl酶标抗体溶液，置于37℃孵育60min；⑤甩干孔内液体，每孔加入300μl洗涤液，静置孵育1min，甩干孔内液体，在吸水纸上拍干，如此重复5次；⑥每孔加入50ul化学发光底物A液和50ul化学发光底物B液，置于化学发光检测仪读取发光值；以校准品浓度为横坐标，发光值为纵坐标，采用四参数逻辑拟合法得到标准曲线如图1所示。根据标准曲线计算待检样本中HPV16型E7蛋白含量为109.42ng/ml，按照结果判读，该样本为阳性，患者需要积极治疗。用本发明试剂盒(如实施例3的检测试剂盒)检测一部分健康人宫颈脱落细胞，检测数据结果如下；表一：检测正常人宫颈脱落细胞数据结果表二：检测病人宫颈脱落细胞数据结果数据分析1、根据正常人检测值，计算出平均值，标准方差，Cutoff值。分别将83例正常人宫颈脱落细胞检测结果取平均数，并计算标准方差SD，本试剂盒在确定Cutoff值时选择正常人平均值加上两倍的标准方差作为HPV16E7蛋白表达阴阳性的判断标准，结果如下：Cutoff计算公式为：cutoff＝平均值+2*SD标准方差表三：检测数据表一统计平均值4.06SD标准方差5.48Cutoff15.02ng/ml2、通过Cutoff值，判断待检样本HPV16E7蛋白表达的阴阳性，超过这个Cutoff值的即认为是阳性，即认为表达了HPV16E7蛋白，同时与病理资料对比。3、表三：根据Cutoff值判断表二病人宫颈脱落细胞诊断结果(“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性)表四：根据表三病人宫颈脱落细胞诊断结果阴阳性制定准确率比例表在表二实验中所检测的病人宫颈脱落细胞共计19例，试剂盒HPV16E7蛋白检测结果为阳性的为14例，诊断灵敏度高达78.9％；其中针对CINII以上病例样本，诊断灵敏度高达80％。当前第1页1 2 3