包括基于金黄色葡萄球菌a蛋白的新配体的层析基质的利记博彩app
【专利说明】包括基于金黄色葡萄球菌A蛋白的新配体的层析基质
[00011 本申请为申请日为2012年6月8日、申请号为201210273398.7、发明名称为"包括基 于金黄色葡萄球菌A蛋白的新配体的层析基质"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2011年6月8日提交的美国临时专利申请61/494701的优先权，在此通 过援引的方式将其全部内容并入本申请。 发明领域
[0004] 本发明涉及层析基质，其包括基于免疫球蛋白结合蛋白（如金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)A蛋白（SpA))的一个或多个结构域的配体，也涉及它们的使用方 法。
【背景技术】
[0005] 用于亲和层析的配体通常对于靶分子具有高选择性，从而能够以高产率、高纯度、 快速且经济的方式纯化靶分子。基于金黄色葡萄球菌A蛋白的试剂和层析介质已经在亲和 层析领域得到广泛应用，用于捕获和纯化抗体和含有Fc的蛋白；由于其能够结合IgG，且不 会显著影响免疫球蛋白与抗原的亲和力，因此在规模化分析抗体检测方法中也得到广泛应 用。
[0006] 因此，包含A蛋白配体的各种试剂和介质已经建立起来并通过商业途径可以获得， 例如 /ProSepdvAHigh Capacity、Pr〇Sep?-vA.Ultra和ProSep? UltraPlus (MILLIPORE)和Protein A Sepharose?、MabSelect?、MabSelect Xtra?、MabSelect SuRe? (GE HEALTHCARE)、MabSelect SuRe? LX和Poros MasCapture A ?(LIFE TECHNOLOGIES)。
[0007] 为了保持层析配体(包括配体结合型固相支持物如结合SpA的层析基质）的选择 性，基质需要进行清洗，而且通常在酸性或碱性条件下清洗，如用氢氧化钠(NaOH)。例如，用 于基质清洗和再生的标准过程是碱性原位清洗(CIP)方法，其通常包括用浓度为0.05M-1M 的NaOH处理结合配体的基质，使pH范围位于12.7-14.0。一般来讲，将亲和层析基质进行重 复原位清洗循环会导致基质对靶分子的结合能力随清洗时间的延长而显著丧失，从而整个 过程需要更多量的通常很昂贵的与基质结合的配体。由于这样会导致纯化过程更加昂贵并 且时间延长，因此既不够经济也不是所期望的。
【发明内容】
[0008] 基于A蛋白的层析基质之前在现有技术中已有描述，其表现出在碱性条件下处理 后对于靶分子的结合能力下降。参见，如公开号为20100221844的美国专利出版物描述的亲 和层析基质以多点连接的方式将野生型(wt)SpA的B或Z结构域结合到基质上，即使用0.5M NaOH处理5小时或更长时间，其也能达到起始结合能力的95%。此外，公开号为20100048876 的美国专利出版物描述了一种结合了野生型SpA的C结构域和含有3-6个氨基酸缺失的C结 构域的亲和层析基质，用〇. 5M NaOH处理约5小时，其达到起始结合能力的95%。这些配体通 过半胱氨酸引导的单点连接方式固定到基质上。进一步地，已经有文献描述了结合在一个 或多个天冬氨酸位点含有突变的A蛋白的层析基质，在碱性条件下处理后，其基质显示出结 合能力相对于野生型SpA有所下降，其通过单点连接方式固定到基质上。参见如US专利 6831161。
[0009] 尽管前述提到的亲和层析基质在苛性条件(caustic conditions)下处理后，似乎 显示出对于靶分子的结合能力有所下降，但在苛性条件下处理后，其中许多基质显示出很 大程度的配体片段化，如使用SDS-PAGE和/或尺寸排阻层析（SEC)可以观察到。由于很大程 度的配体片段化产生的配体小片段难以从靶分子中去除和分离，从而增加潜在的免疫原性 片段与治疗性靶分子共纯化的可能，因此这种片段化是不利的。此外，很大程度的片段化导 致加剧基质与祀分子结合能力的下降。
[0010] 本发明提供了亲和层析配体和结合该配体的基质，其中所述配体基于一个或多个 金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA)的结构域，该结构域具有从N末端第1位或第2位起始的缺失突 变。这些配体和基质在纯化使用时的片段化问题相对于之前描述的配体有所下降，这一点 通过SDS-PAGE和/或SEC技术可以证实，从而使得它们成为用于亲和层析的更有吸引力和更 加经济的选择。
[0011] 本发明的一个方面提供了亲和层析基质，其包括具有缺失突变的一个或多个SpA 蛋白B结构域，具有缺失突变的一个或多个SpA蛋白C结构域或具有缺失突变的一个或多个 SpA蛋白Z结构域，其中一个或多个结构域结合到固相支持物上。
[0012] 在一个实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其 中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA)B结构域，其中至少一个B结构域包 含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。在另一实施方式中，本发明的亲和层析基质包 括结合到固相支持物上的配体，其中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA) 的C结构域，其中至少一个C结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。
[0013] 在另一实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其 中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA)的Z结构域，其中至少一个Z结构域 包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。
[0014] 在又一实施方式中，本发明的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其 中所述配体包含两个或更多个B结构域，两个或更多个C结构域或两个或更多个Z结构域，或 B、C和Z结构域的任意组合，其中至少一个B、C或Z结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基 酸的缺失。
[0015] 在本发明的各种实施方式中，每个配体上多于一个位点连接到固相支持物（即多 点连接）。
[0016] 在本发明的各种实施方式中，所述配体或含有配体的基质经0.5M NaOH处理至少5 小时后，配体相对于其野生型对应物显示出降低的片段化，这通过SDS-PAGE或尺寸排阻层 析(SEC)可以确定。
[0017] 在本发明的一些实施方式中，所述配体包含N末端3个氨基酸缺失，N末端4个氨基 酸缺失，或N末端5个氨基酸缺失，其中配体上多于一个位点连接到固相支持物，从而形成亲 和层析基质。
[0018] 在一特定的实施方式中，配体具有SEQ ID N0:13-42、SEQ ID N0:55-84和SEQ ID NO: 93-94中任一所示的氨基酸序列。
[0019]在另一实施方式中，本发明的配体具有下列结构：[(X)n，（Y)m] n+m，其中X代表SpA蛋 白的B结构域、Z结构域或C结构域，η代表从零至(m-1)范围的结构域数目，Y代表N末端缺失 至少3个连续氨基酸的SpA蛋白B结构域、Z结构域或C结构域，m代表范围是1-8的Y结构域的 数目，其中所述配体多于一个位点连接到固相支持物(如层析基质）。
[0020] 在本发明的一些实施方式中，所述配体包含SpA蛋白的两个B结构域或两个Z结构 域或两个C结构域，或一个B和一个C结构域，或一个B和一个Z结构域，或一个C和一个Z结构 域，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基 酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。应该理解，各种结构域可 以任意顺序分布。
[0021] 在另一实施方式中，本发明的配体包含三个B结构域或三个Z结构域或三个C结构 域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域 或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个 连续氨基酸缺失。
[0022] 在又一实施方式中，本发明的配体包含四个B结构域或四个Z结构域或四个C结构 域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域 或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个 连续氨基酸缺失。
[0023] 在又一实施方式中，本发明的配体包含五个B结构域或五个Z结构域或五个C结构 域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域 或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个 连续氨基酸缺失。
[0024] 在又一实施方式中，本发明的配体包含六个B结构域或六个Z结构域或六个C结构 域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域 或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个 连续氨基酸缺失。
[0025] 在又一实施方式中，本发明的配体包含七个B结构域或七个Z结构域或七个C结构 域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域 或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个 连续氨基酸缺失。
[0026] 在进一步的实施方式中，本发明的配体包含八个B结构域或八个Z结构域或八个C 结构域，或B、C或Z结构域按照任意顺序的任意组合，其中至少一个B结构域或至少一个Z结 构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末 端5个连续氨基酸缺失。
[0027] 此外，本发明提供了亲和层析基质的使用方法。因此，提供了从样品中亲和纯化一 种或多种靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白）的方法，所述方法包含下列步骤：（a)提供 包含一种或多种靶分子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白）的样品；（b)在使一种或多种靶分 子(如免疫球蛋白或含有Fc的蛋白）结合到基质上的条件下将样品与本发明的基质接触;和 (c)在适宜的条件如适宜的pH条件下，通过洗脱回收一种或多种结合的靶分子(如免疫球蛋 白或含有Fc的蛋白）。
[0028] 在一些实施方式中，本发明的亲和层析基质经0.5M NaOH温育5小时或10小时或15 小时或20小时或25小时或30小时后保留了初始靶分子结合能力的至少95%。
[0029]在特定实施方式中，本发明的亲和层析基质经0.5M NaOH温育5小时后保留了初始 结合能力的至少95%。
[0030] 在又一实施方式中，本发明的亲和层析基质经0.1M NaOH温育25小时后保留了初 始靶分子结合能力的至少95% ;经0 · 3M NaOH温育25小时后保留了初始靶分子结合能力的 至少85% ;或经0.5M NaOH温育25小时后保留了初始靶分子结合能力的至少65%。
[0031] 能被这里描述的不同配体结合的免疫球蛋白包括：如IgG、IgA和IgM，或包含抗体 和任意抗体片段的、能与Sp A结合的任意融合蛋白。
[0032] 本发明还提供了编码本发明所描述的不同配体的核酸分子，以及包括所述核酸分 子的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在另外的实施方式中，宿主细胞 是真核细胞。
[0033] 在一些实施方式中，本发明提供了基于SpA的亲和层析基质，其与免疫球蛋白Fab 段的结合与野生型SpA配体相比发生了改变(升高或下降），同时保留了与免疫球蛋白Fc段 结合的能力。在一个实施方式中，本发明基于SpA的基质与免疫球蛋白Fab段的结合与野生 型SpA相比出现下降。在一特定实施方式中，层析基质结合SpA配体，该配体包括在第29位以 赖氨酸替代甘氨酸(对于SpA的B和C结构域)或替代丙氨酸(对于SpA的Z结构域）。
[0034] 附图简述
[0035]图1描述了 SpA的野生型(wt)IgG结合结构域以及Z结构域的氨基酸序列比对，如 SEQ ID N0:1-6所示。
[0036] 图2描述了含有编码带有A29K突变的二聚化Z结构域配体的核苷酸序列的pETlla 质粒图谱，其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:85(对照），以及编码带有A29K突变和第二结构 域包括N末端4个连续氨基酸缺失的二聚化Z结构域配体的核苷酸序列的pETl la质粒图谱， 其氨基酸序列显示于SEQ ID N0:78。配体构建物进一步包括3'端的His-tag序列。
[0037] 图3是考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，用于分析游离或固定化的二聚化Z和C配体 经过或不经过0.5M NaOH苛性浸泡（caustic soak)25小时的片段化分布情况。SDS-PAGE胶 各泳道解释如下：泳道1:分子量标志；泳道2:二聚化Z结构域配体不经过苛性处理(A29K，无 缺失，序列如SEQ ID N0:85所示，用作对照，有His-tag);泳道3:二聚化Z结构域配体对照经 过0.5M NaOH浸泡25小时;泳道4:固定到琼脂糖层析树脂上的二聚化Z结构域配体对照经过 0.5M NaOH浸泡25小时;泳道5:第二结构域N末端具有4个连续氨基酸缺失的二聚化Z结构域 配体不经过碱性处理(A29K，第二结构域有缺失，序列如SEQ ID N0:78所示，有His-tag);泳 道6:SEQ ID N0:78所示的、有His-tag的二聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳 道7:有His-tag、固定到琼脂糖层析树脂上的、SEQ ID N0:78所示的二聚化Z结构域配体经 过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道8:用作对照的、无缺失的二聚化C结构域配体不经过苛性处 理(氨基酸序列如SEQ ID N0:92所示;有His-tag);泳道9:二聚化C结构域配体对照经0.5M NaOH浸泡25小时；泳道10:固定到琼脂糖层析树脂上的二聚化C结构域配体经0.5M NaOH浸 泡25小时；泳道11:第二结构域N末端有缺失的二聚化C结构域配体(氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示，有Hi s-tag);泳道12: SEQ ID NO: 35所示的、有Hi s-tag的二聚化C结构域配体经 0.5M NaOH浸泡25小时；泳道13:SEQ ID N0:35所示的、有His-tag的、固定到琼脂糖层析树 脂上的二聚化C结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时。
[0038]图4是上述图3概述的二聚化Z和C配体的尺寸排阻层析(SEC)结果。X轴代表保留时 间，以分钟表不，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以mAU表 示。层析图上的方框表明第二结构域N末端有缺失的二聚化Z和C结构域配体经长时间碱性 处理（如0.5M NaOH处理25小时）后的降低的片段化，箭头所示的二聚化Z和C结构域对照中 存在的小片段。
[0039]图5是考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，用于分析游离或固定化的五聚化Z结构域配 体经过或不经过0.5M NaOH苛性浸泡25小时的片段化分布情况。SDS-PAGE胶各泳道解释如 下:泳道1:分子量标志;泳道2:具有A29K突变的、除第一结构域外其余均具有N末端4个连续 氨基酸缺失的五聚化Z结构域配体，氨基酸序列如SEQ ID N0:84所示，不经过苛性处理;泳 道3: SEQ ID N0:84所示的五聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时；泳道4: SEQ ID NO: 84所示的、固定到琼脂糖层析树脂上的五聚化Z结构域配体经过0.5M NaOH浸泡25小时； 泳道5: SEQ ID N0:91所示的五聚化Z结构域配体，用作对照，不经过苛性浸泡；泳道6:五聚 化Z结构域配体对照经过0.5M NaOH浸泡25小时;泳道7:固定到琼脂糖层析树脂上的五聚化 Z结构域配体对照经过0.5M NaOH浸泡25小时;进一步，泳道8、9和10:是重组SPA(rSPA)经过 相似处理的结果，其中泳道8代表rSPA不经过苛性浸泡;泳道9代表rSPA经过0.5M NaOH浸泡 25小时以及固定化的rSPA经过0.5M NaOH浸泡25小时。条带代表片段化，以箭头标出。
[0040] 图6是上述图5概述的五聚化Z结构域配体的尺寸排阻层析(SEC)结果。X轴代表保 留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以mAU 表示。证据表明：除第一结构域外其余均具有N端缺失的五聚化Z结构域配体经长时间苛性 浸泡后的降低的片段化，这通过层析图上的方框可以看出，五聚化Z结构域对照中存在的小 片段用箭头标出。进一步，rSPA的大量片段化也可以通过SEC观察到。
[0041] 图7是上述图5概述的固定化五聚Z结构域配体的尺寸排阻层析（SEC)结果。X轴代 表保留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值， 以mAU表示。证据表明：第二结构域N端缺失的固定化五聚Z结构域配体经长时间苛性浸泡后 的降低的片段化，这通过层析图上的方框可以看出，五聚化Z结构域对照中存在的小片段用 箭头标出。进一步，rSPA的大量片段化也可以通过SEC观察到。
[0042] 图8是游离的二聚化Z结构域配体经长时间苛性浸泡后的尺寸排阻层析（SEC)结 果，其中所述配体包括在二聚化配体的第二结构域N端缺失第一个(SEQ ID N0:87)，缺失前 二个（SEQ ID NO:88)，缺失前三个（SEQ ID NO:69)或缺失前四个（SEQ ID NO:78)<^轴代表 保留时间，以分钟表示，小分子比大分子的保留时间长。y轴代表在280nm的紫外吸收值，以 mAU表示。证据表明，第二结构域N端缺失前三个或前四个氨基酸的二聚化配体经长时间苛 性浸泡后的降低的片段化，以方框标出。第二结构域N末端无氨基酸缺失（SEQ ID N0:85)或 缺失第一个或前二个氨基酸的二聚化配体经长时间苛性浸泡后出现片段化，通过箭头所指 的层析片段可以显示出来。
[0043]图9比较了固定化C结构域五聚体经过反复苛性处理后保留的结合能力，其中一个 五聚体配体的每个结构域都包括N末端四个氨基酸缺失，在五聚体中每个结构域都有G29K 突变，并且第一位氨基酸均为丙氨酸(氨基酸序列如SEQ ID N0:93所示）；另一五聚体配体 是具有G29K突变的野生型（氨基酸序列如SEQ ID N0:95所示hx轴代表逐渐增加的处理时 间，层析基质经过0.7M NaOH处理16个循环、每循环30分钟。y轴代表保留的结合能力百分 数。
[0044]发明详述
[0045]本发明提供了结合基于SpA的一个或多个结构域的配体的亲和层析基质，其中所 述单独存在或固定于基质的配体在用于纯化过程中时相对于SpA野生型结构域显示出降低 的片段化。
[0046]基于SpA的层析配体先前已经有示例性描述，包括，如公开号为20100221844的美 国专利出版物描述的亲和层析基质结合野生型(wt)SpA的B或Z结构域，其中配体上多于一 个位点结合到层析基质上（即多点结合）；公开号为20100048876的美国专利出版物描述了 一种结合野生型SpA的C结构域的层析配体，其能够与多种抗体的Fab段结合，并通过末端偶 联基团在单一位点偶联到不溶性载体上;US6831161描述了基于SpA的碱性层析配体，其中 一个或多个天冬氨酸残基进行了修饰。
[0047] 如上述所讨论的，这些配体在碱性条件处理后结合能力出现下降，其中许多配体 在纯化使用过程中