用于样品制备的反应容器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分纯化和/或富集生物有机化合物的样品制备容器，容器包括反应室和层析介质；其中，所述反应室用于保持所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分，并且配置为使得可以在其中实施以下反应的至少一个:裂解，例如，通过声波处理和/或蒸煮；层析纯化；还原；烷基化；以及诸如蛋白水解的酶促反应；其中，所述层析介质配置为纯化和/或富集所述生物有机化合物；其中，(a)所述层析介质位于所述反应室的壁上，并且所述壁是闭合或密封的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放；或(b)所述样本制备容器还包括用于接收所述生物有机化合物的接收室，所述接收室邻近所述层析介质，从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开，并且所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。
【背景技术】
[0002]在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商的手册的许多文件。虽然不认为和本发明的专利性相关，但是这些文件的全部公开内容结合于此作为参考。更具体地，所有参考文件均相同程度地结合于此作为参考，犹如每个单独的文件特定和单独地结合于此作为参考。
[0003]用于富集特定生物材料的包括细胞裂解的样本制备方法当前应用于生物研宄的基本上所有领域。DNA、RNA和蛋白质的提取、纯化和处理是用于这些和其他生物材料的体外分析的起始步骤。当前的方法涉及预净化步骤和将这些材料转移至不同的反应容器以避免阻塞诸如分析柱的分析设备以及有时富集期望的生物材料。样品的纯化在诸如结晶学和电子显微镜的生物研宄的某些领域被视为是重要的。这些预清洗和样品转移步骤在样品损失、延长的样品制备时间、例如将分析的蛋白质的不期望的改性、污染的引入、在处理有害或传染性材料中的潜在危害以及材料成本方面显示出一些主要缺点。但是，它们通常被视为是不可缺少的。
[0004]由于不完全的提取以及与容器表面的扩大接触(其中发生样品吸收)，在预清洗粗制的裂解液的步骤中发生样品损失。减少样品损失的当前的解决方案包括非常严密的提取方法和反应管上的低结合表面。
[0005]反复的样品转移花费时间；尤其是研宄者必须存在和需要处理样品的手工操作。延长的UV光或氧暴露可能损坏样品并且可以导致不期望的化学改性。这些问题的解决方案分别是光保护容器和屏蔽气体的使用。然而，这些措施使样品处理变得更加困难和耗时。此外，在容器之间传递样品期间可能引入污染，并且目前仅可以通过在昂贵的超净工作台、层流下或具有类似的预防措施下工作来避免污染。此外，诸如病原体的有害样品带来污染与样品管接触的人或机器的风险。最后，样品制备中的任何这些低效率以及多于最少量的一次性材料的使用都可以显著地增加处理成本。
[0006]包括层析材料的诸如移液吸头的设备在本领域是已知的并且可以从若干制造商购买并且包括Pierce C-18吸头(Thermo Fisher)和C18-SD盒(3M)。这些设备在两端均开口。这样的设备不适合于单反应容器中的样品制备。本文中的样品制备包括从细胞材料制备用于质谱分析的肽和多肽和/或从细胞材料制备用于表达谱的核酸。
[0007]Rappsilber 等人(Anal Chem.;75 (3): 663-70 (2003))描述了也称为“阶段吸头”的设备，“阶段吸头”在两端均开口并且允许以紧凑的格式层析的性能。
[0008]欧洲专利申请EP1033169描述了用于固相萃取的吸附剂盒。根据EP1033169的盒的特征是在吸头的远端处具有开口，该开口标示有标号(18)，该开口对于盒的功能是必要的。在远端处提供了固相萃取材料，优选地，以珠子的形式。虽然盖(32)关闭吸附剂盒的近端，但是远端需要是开放的或打开以使原材料与珠子接触。本发明的设备的底部(当使用EP1033169的术语时为“远端”)由闭合或密封的壁制成或者以闭合的接收室的形式提供。然而加载原材料是可能的，即在上(“近”)端。然而，根据EP1033169的样品加载仅当远端开放时是可能的。
【发明内容】
[0009]鉴于本领域中可用的工具和方法的限制，本发明的技术问题可以视为提供用于样品制备的设备和方法，其中，所述样品制备在单反应容器中实现而不用任何转移步骤。
[0010]因此，本发明的第一方面涉及用于从细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分纯化和/或富集生物有机化合物的样品制备容器，容器包括反应室和层析介质；其中，所述反应室用于保持所述细胞材料、病毒和/或所述细胞材料和/或病毒的亚组分，并且配置为使得可以在其中实施以下反应的至少一个:裂解，例如，通过声波处理和/或蒸煮；层析纯化；还原；烷基化；以及诸如蛋白水解的酶促反应；其中，所述层析介质配置为纯化和/或富集所述生物有机化合物；其中，(a)所述层析介质位于所述反应室的壁上，并且所述壁是闭合或密封的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放；或(b)所述样本制备容器还包括用于接收所述生物有机化合物的接收室，所述接收室邻近所述层析介质，从而使得所述层析介质将所述反应室和所述接收室分隔开，并且所述接收室的外面是闭合的并且配置成为获得纯化和/或富集的生物有机化合物而开放。
【具体实施方式】
[0011]术语“样品”指的是为随后的分析准备的组合物。例如，如果所述生物有机化合物是肽或多肽，优选的随后的分析是通过质谱分析。根据本发明的样品制备容器是用于获得这样的样品的工具。通常来说，所述样品包括或由所述纯化和/或富集的生物有机化合物组成，本文中也称为“分析物”。
[0012]通常地，样品制备容器可以是圆锥形的、盒形的或圆柱形的。容器的体积可以适合于从 10μ1 至 150“1(包括2(^1、3(^1、4(^1、5(^1、6(^1、7(^1、8(^1、9(^1 和100 μ I)的样品体积以及任何更大的150 μ I以上的体积。然而，样品制备容器的总体积可以显著高于其适合的体积。例如，在圆锥形容器的情况下，基圆半径可以在Imm和5mm之间(诸如1.5mm>2mm或3mm)，并且高度可以在1mm和150_之间(诸如25mm)。
[0013]应该理解，配置为使得可以在其中实施裂解的反应室配置为实施本领域构建的裂解方法，本领域构建的裂解方法包括但不限于超声处理、珠磨和/或蒸煮。
[0014]在选择(a)的情况下，制备容器还可以包括接近闭合或密封的壁的连接器，例如，螺旋连接器，以用于连接在外部接收室内。这样的外部接收室包括连接器的相应的配对物，例如，匹配制备容器的内螺纹的外螺纹。外部接收室可以额外地包括打开工具，打开工具配置为当紧紧附接至壁时打开壁。这些工具可以是螺纹的端部处的锐缘的延伸件，当接收室紧拧在制备容器的螺旋连接件中时，延伸件穿透壁。因此，壁可以具有薄壁刚性塑料材料或柔性塑料材料，这两种材料均配置为用所述锐缘的延伸件穿透。
[0015]在选择(b)的情况下，接收室的外面，即，接收室的与层析介质和反应室相对的自由端，可以是薄壁，从而使得可以通过剪刀或手术刀剪断。例如，当容器是圆锥形时，外面可以是可分离的圆锥体的尖端以用于获得纯化和/或富集的生物有机化合物。
[0016]根据本发明的容器提供了单个反应容器中的样品制备。本发明发现，预清除和样品转移步骤不仅是缺点，而且对于纯化是可有可无的，纯化诸如用于通过基于质谱分析的蛋白质组学的随后的分析的蛋白质水解的多肽或肽富集或纯化。该发现对膜和核酸结合蛋白特别有利，主要是因为这样的蛋白在液体中的完全溶解是困难的并且由于它们的生物化学行为可能甚至在特定情况下是不可能的。特别地，本发明发现，可以在单个反应容器中实施所有样品裂解、样品改性、酶促反应、纯化和富集。该单个容器解决方案显著地减少了样品损失，这在当与极少的样品量一起工作时最为突出。本发明允许非常小的样品量或数量非常少的细胞的分析。此外，在单个容器中实施所有反应减少了处理时间，尤其是手工操作时间。这些改进使具有本领域机械的状态的简单组合的处理步骤的自动化至比先前可能的高得多的程度成为可能。
[0017]由于提高的样品制备速度，减少了由样品制备导致的诸如蛋白和核酸的分析物的不期望的改性。高效的工序减少了所需的化学物质的量以及一次性管或吸头的量，从而导致成本降低；因此，处理步骤的自动化减少了手工操作时间、在工作时间方面的成本以及在一次性使用设备方面的成本。
[0018]应该理解，术语“包括”包括“由…组成”。同样地，应该理解，当“包括”后面跟随一列试剂时，“包括”提供闭合的一列试剂，但是不排除另外的化合物的存在，其中，化合物不视为是试剂。例如，不视为是试剂的化合物是水。这也适用于缓冲溶液。
[0019]在优选的实施例中，所述生物有机化合物或分析物包括以下的至少一种:蛋白；肽;多肽;核酸，例如，脱氧核糖核酸和核糖核酸；包括脂肪酸的脂质；以及代谢物。
[0020]通常来说，生物有机化合物是在生物系统中自然存在的有机化合物。有机化合物是包括一个或多个碳原子的化合物。生物系统可以是包括单细胞有机体和多细胞有机体的有机体、组织、来自有机体或组织的细胞类型、培养中的细胞、诸如细胞器的细胞材料的亚组分，细胞器包括线粒体、叶绿体、溶酶体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、细胞核、核仁、核糖体、微管、中心体与蛋白酶体。此外，生物系统包括病毒和它的亚组分。术语“亚组分”包括大分子组合体。
[0021]肽和多肽是氨基酸的缩聚物，优选地具有二十个自然存在的氨基酸。通常地，肽包含两个氨基酸和三十个氨基酸之间，而多肽包含多于三十个氨基酸。
[0022]核酸是核苷酸的缩聚物。根据本发明的术语“核酸”包括DNA (诸如cDNA和基因组DNA)和RNA。RNA包括所有形式的RNA，包括mRNA、非编码RNA、tRNA和rRNA。非编码RNA的实例包括siRNA、miRNA、复制相关的RNA、小核仁RNA和小核RNA。
[0023]术语“脂质”是本领域公知的并且涉及显著地亲脂性/疏水性分子，亲脂性/疏水性分子可以携带极性头基，从而使脂质分子具有两亲性。脂质包括简单的脂质，诸如碳氢化合物(三十烷、角鲨烯、类胡萝卜素)、醇类(蜡醇、视黄醇、胆固醇、线性单或多羟基碳氢化合物，优选地具有两到约30个碳原子)、醚、脂肪酸和诸如单、二和三酰甘油的酯。此外，包括诸如脂蛋白、磷脂和糖脂的复杂脂质。磷脂进而包括甘油磷脂，诸如磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰甘油、心磷脂、双溶血磷脂(Iysobisphosphatidic)酸、卵磷脂、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷酸脂(phosphonolipids)。糖脂包括甘油糖脂，诸如单和双半乳糖甘油二酯和硫酸甘油糖脂。根据本发明的术语“脂质”也包括鞘磷脂、鞘糖脂和神经酰胺。
[0024]术语“代谢物”通常定义为涉及中间产物的小分子以及代谢和信号传导中的产物。这些包括分类为代谢中间产物、诸如荷尔蒙的信号传导分子和次级代谢物的代谢物。
[0025]在进一步优选的实施例中，容器包括盖，所述盖配置为密封反应室的开口和配置为允许样品的给料，例如，通过用针头穿透，以及优选地配置为在给料之后自动再密封。该优选的实施例提供了(完全)闭合的样品制备容器。
[0026]盖配置为密封该管的选择容易地使得在必要的地方在屏蔽气体下工作成为可能，这降低了氧化。密封该