分离或富集细胞的方法和成分的利记博彩app
【专利说明】分离或富集细胞的方法和成分 相关申请的夺叉引用
[0001] 本申请要求2013年3月15日提交的序列号为13/844, 085的名称为"分离或富集 细胞的方法和成分"的尚未授权的美国专利申请的优先权，该申请要求2012年7月6日提交 的序列号为61/668, 990的名称为"分离或富集细胞的方法和成分"的美国专利申请的优先 权。本申请涉及2007年7月13日提交的序列号为11/777, 962的名称为"从生物样品中检 测稀有细胞的方法和成分"的目前已撤销的美国专利申请、2006年7月14提交的序列号为 60/831，156的名称为"从生物样品中检测稀有细胞的方法和成分"的美国专利申请、2006 年8月2日提交的序列号为11/497, 919的名称为"从液体样品中分离稀有细胞的方法和成 分"的尚未授权的美国专利申请、2005年8月2日提交的序列号为60/704, 601的名称为"从 液体样品中分离稀有细胞的改良的方法和成分"的美国专利申请、2005年10月31日提交 的序列号为11/264, 413的名称为"从血液样品中检测非造血细胞的方法和成分"的目前已 授权的美国专利申请、2005年8月2日提交的序列号为60/704, 601的名称为"从液体样品 中分离稀有细胞的改良的方法和成分"的美国临时专利申请、2004年9月15日提交的序列 号为PCT/US2004/030359的名称为"从液体样品中分离稀有细胞的方法、成分及自动系统" 的美国专利申请、2003年11月4日提交的序列号为10/701,684的名称为"从液体样品中 分离稀有细胞的方法、成分及自动系统"的美国专利申请，目前美国专利号为7, 166, 443B2、 2002年10月10日提交的序列号为10/268, 312的名称为"从液体样品中分离稀有细胞的 方法、成分及自动系统"的美国专利申请，目前美国专利号为6, 949, 355 B2、2001年10月 29日提交的序列号为60/348,228的名称为"从液体样品中分离稀有细胞的方法和自动系 统"的美国临时专利申请、2001年10月11日提交的序列号为60/328, 724的名称为"从液 体样品中分离稀有细胞的方法和自动系统"的美国临时专利申请，以及2002年7月9日提 交的序列号为60/394, 517的名称为"从液体样品中分离稀有细胞的方法和自动系统"的美 国临时专利申请。上述引用的专利、专利申请和临时专利申请的内容通过引用全部包含于 本文中。
技术领域
[0002] 本发明主要涉及生物分离领域，尤其涉及生物样品处理领域。
【背景技术】
[0003] 样品制备是许多生物和环境样品的遗传、生物化学和生物分析的必要步骤。样品 制备经常需要将感兴趣的样品成分从样品剩余成分中分离出来。这种分离常常是劳动密集 的并且难以自动化。
[0004] 在许多情况下需要分析样品中相对稀少的成分。在这种情况下，可能需要提高待 分析的稀有成分的浓度，同时去除样品中可能干扰感兴趣成分分析的不需要的成分。因此， 必须将样品"压实"以减小它的体积，然后通过能够富集感兴趣成分的分离技术进行分离。 生物样品尤其符合这一点，例如腹水、淋巴液或血液，它们可以被大量收集，但可能含有极 小比例的目标细胞（例如病毒感染的细胞、抗肿瘤T细胞、炎症细胞、癌细胞或胎细胞），其 分离对于了解疾病状况的基本规律及诊断和治疗方法的开发极其重要。
[0005] 基于样品成分流过或被过滤器保留的能力，过滤已作为减小样品体积以及分离样 品成分的方法使用。通常将膜过滤器用于这样的应用中，其中膜过滤器具有互相连接、纤维 样结构分布，并且膜上的孔不是分散隔离的；相反地，膜上的孔具有不规则形状并在膜上相 互连接。所谓的"孔"径实际上取决于膜上流体流动空间（例如，孔）的随意弯曲。虽然膜 过滤器可以用于许多分离应用，但孔径的变化和孔的不规则形状阻碍了它们用于基于颗粒 大小和其它性质的精确过滤。
[0006] 微型过滤器已被制作用于一些细胞或分子的分离应用。这些微型结构不具有孔， 而是包括通道，其通过在建造于芯片表面上的"砖状物"（参见，例如，通过引用包含于此的 1998年11月17日颁发给Austin等人的美国专利5, 837, 115)或障碍物（参见，例如通过 引用包含于此的1998年3月10日颁发给Wilding等人的美国专利5,726, 026)微刻到一 个或多个芯片中。虽然这些微型过滤器具有精确的几何形状，但是受到这些过滤器几何形 状的限制，其局限是所述过滤器的过滤区域小，因此这些过滤器只能处理小量的液体样品。
[0007] 血液样品给样品制备和分析带来了特殊的挑战。血液样品容易从受试者获得， 并且能够提供大量的新陈代谢的、诊断的、预后的和遗传的信息。然而，大量无核红细 胞和它们的主要成分血红蛋白，可能妨碍遗传的、新陈代谢的和诊断性检测。来自外周 血液的红细胞的压实已经使用不同层次的浓溶液（例如，参见1995年8月1日颁发给 丁6叩，他18〇11111.等人的美国专利5,437,987)实现。长链聚合物例如右旋糖酐已用于 诱导红细胞的聚集，从而形成长的红细胞链（Sewchand LS, Canham PB. (1979) 'Modes of Rouleaux formation of human red blood cells in polyvinylpyrrolidone and dextran solutions' Can. J. Physiol. Pharmacol. 57(11) : 1213-22.)。然而，这些方法去除红细胞 的效率还不是最理想，尤其是想要从患者母血或者癌细胞中分离或富集稀有细胞例如胎 细胞时。细胞裂解技术也已经用于去除红细胞。然而，细胞裂解技术的缺点包括作为细 胞裂解结果的非特定的有核细胞裂解、红细胞碎片，以及可能的细胞体积改变（Resnitzky P, Reichman N. (1978) 'Osmotic fragility of peripheral blood lymphocytes in chronic lymphatic leukemia and malignant IymphomajBlood 51 (4):645-651)〇
[0008] 体液（例如痰、尿或者乃至腹水或其它渗出物）中的脱落细胞为癌前病变的检 测和肿瘤发展早期癌症的根除提供了重要的时机。例如，尿液细胞学作为移行细胞癌 诊断和监测的非损伤性检测被普遍接受（Larsson et al(2001)Molecular Diagnosis 6:181-188)。然而，在许多情况下，异常脱落细胞的细胞学鉴定受到分离的异常细胞数量的 限制。对于常规的尿液细胞学（Ahrendt et al. (1999)J.Natl. Cancer Inst.91:299_301)， 总的灵敏度低于50%，所述灵敏度随着肿瘤级别、肿瘤阶段及使用的尿液收集和处理方法 的不同而不同。基于分子和遗传生物标记的体液中异常脱落细胞的分子分析（例如使用原 位杂交、PCR、微阵列等）能够显著提高细胞学灵敏度。生物标记研究和临床实践中生物标 记的使用都需要从体液中富集的相对纯的脱落细胞群，所述体液不仅包含脱落细胞，还包 含正常细胞、细菌、体液、体蛋白和其它细胞碎片。因此，目前需要研发一种有效的从体液中 富集和分离脱落的异常细胞的富集方法。
[0009] Meye et al.，Int. J. Oncol.，21 (3) :521-30(2002)描述了通过半自动 CD45 消耗 自动磁性细胞分离方法从血液样品中分离和富集泌尿系肿瘤细胞。Iinuma et al.，Int. J. Cancer，89(4) :337-44(2000)描述了在结肠直肠癌患者的血液中使用CD45磁性细胞分 离及随后的P53和K-ras基因的巢式突变等位基因特异性扩增的方法来检测肿瘤细胞。在 两项研究中，肿瘤细胞与通过聚蔗糖梯度离心从血液样品中分离出来的单核细胞（MNCs) 混合在一起。然后通过使用抗CD45抗体负消耗的方法将肿瘤细胞从单核细胞中富集。
[0010] 用于从体液例如血液样品中富集和制备脱落细胞的现有方法采用基于介质的分 离、抗体捕获、离心和膜过滤。虽然这些技术简单且直接，但它们受到许多限制，包括：稀有 细胞富集效率不高；稀有细胞检测灵敏度低；难以处理大量样品；富集性能不稳定；以及劳 动密集型的分离过程。
[0011] 目前需要提供有效的和/或可自动化的能够处理相对大量的样品（例如大量的生 物液体样品）并分离目标细胞的样品制备方法和设备。本发明提供了具有这些优势及其它 益处的方法和设备。
【发明内容】
[0012] 在某些方面，本发明认识到许多疾病的诊断、预后和治疗有赖于从复杂的液体样 品中富集目标细胞和/或细胞器。通常，使用具有狭缝的过滤装置根据细胞的大小、形状、 可塑性、亲和性和/或结合专一性过滤细胞，通过一个或多个分离步骤可以实现富集。例 如，使用过滤装置可以将外周血中的有核细胞从无核红细胞中分离出来。与基于细胞裂解 技术去除红细胞相比，本申请公开的过滤装置可以基于细胞的大小、形状、可塑性、亲和性 和/或结合专一性来消除红细胞，并最大程度地降低因非特异性裂解导致的有核细胞的损 失。此外，可以使有核细胞的体积改变最小并且不需要离心步骤。
[0013] 特别是，从母血样品中分离胎细胞可以极大地促进胎细胞异常或多种遗传情况的 检测。在某些方面，本发明认识到从患者样品中富集或分离稀有的恶性细胞，例如从患者体 液样品中分离癌细胞，能促进这种恶性细胞的检测和分类，并因此促进诊断和预后以及患 者治疗方式的发展。
[0014] 第一方面，本发明提供一种过滤室，所述过滤室包括装在外罩里的微型过滤器，其 中所述过滤室包括前室和过滤后亚室，所述前室中的液体流动路线与所述过滤后亚室中的 液体流动路线基本相反。在一些实施例中，所述前室和过滤后亚室分别具有流入口和/或 流出口。在一些实施例中，所述前室包括至少两个流入口。在一些实施例中，所述前室包括 上部过滤器，由此产生上室，其中上部过滤器可以置于微型过滤器对面。在一些实施例中， 位于前室和上室之间的上部过滤器在低流速情况下足以严格保持其平面度。在一些实施例 中，所述上部过滤器包括开口小于大约5微米的孔或狭缝。在一些实施例中，流入口和流出 口可以交替使用。在一些实施例中，所述微型过滤器包括一个或多个锥形狭缝。在一些实 施例中，所述微型过滤器包括大约100至5, 000, 000个锥形狭缝。在一些实施例中，所述微 型过滤器的厚度为大约20至大约200微米。在一些实施例中，所述微型过滤器的厚度为大 约40至大约70微米。在一些实施例中，所述锥形狭缝的长度为大约20微米至200微米， 宽度为大约2微米至大约16微米，所述狭缝的逐渐变细是从大约0级至大约10级，所述锥 形狭缝的狭缝大小的变化小于大约20%。在一些实施例中，所述锥形狭缝的大小变化大于 20%。在一些实施例中，所述锥形狭缝的大小变化大于50%。在一些实施例中，所述锥形 狭缝的大小变化大于100%。在一些实施例中，所述锥形狭缝的大小沿着前室的液体流道 变化。在一些实施例中，所述过滤后亚室包括至少两个流出口。在一些实施例中，所述至少 两个流出口沿着前室的液体流道排列。在一些实施例中，所述过滤室包括两个或多个电极。 在一些实施例中，所述电极置于微型过滤器的对面。在一些实施例中，所述电极置于过滤室 外罩上。在一些实施例中，所述电极置于前室和/或过滤后亚室中。在一些实施例中，所述 电极整合于或放置于所述流出/入口中或前室和/或过滤后亚室相互连接处。在一些实施 例中，所述过滤室包括至少一个声学元件。在一些实施例中，所述前室的流出口与收集室或 收集孔连接。在一些实施例中，所述外罩包括顶部和底部，顶部和底部相互配合并可随意地 结合在一起形成所述过滤室。在一些实施例中，所述过滤室的长度为大约Imm大约10cm，宽 度为大约Imm至大约3cm，深度为大约0. 02mm至大约20mm。在一些实施例中，所述过滤室 的长度为大约IOmm至大约50mm，宽度为大约5mm至大约20mm，深度为大约0. 05mm至大约 2. 5_。在一些实施例中，所述过滤室的长度为大约30_，宽度为大约6_，深度为大约1_。 在一些实施例中，包含过滤室的外罩的外部尺寸为：长度大约38mm，宽度大约12mm，深度大 约20_。在一些实施例中，所述前室的长度为大约Imm至大约10cm，宽度为大约Imm至大 约3cm，深度为大约0.0 lmm至大约10mm。在一些实施例中，所述前室的长度为大约IOmm至 大约50mm，宽度为大约5mm至大约20mm，深度为大约0? Olmm至大约1mm。在一些实施例中， 所述前室的长度为大约30mm，宽度为6mm，深度为大约0. 1-0. 4mm。在一些实施例中，所述前 室的体积为大约〇. 01 U L至大约5mL。在一些实施例中，所述前室的体积为大约I ii L至大 约IOOy L。在一些实施例中，所述前室的体积为大约40-80ii L。在一些实施例中，所述过 滤后亚室的长度为大约Imm至大约10cm，宽度为大约Imm至大约3cm，深度为大约0.01mm 至大约lcm。在一些实施例中，所述过滤后亚室的长度为大约IOmm至大约50mm，宽度为大 约5mm至大约20mm，深度为大约0. 2mm至大约I. 5mm。在一些实施例中，所述过滤后亚室的 长度为大约30mm，宽度为大约6. 4mm，深度为大约0. 6-lmm。
[0015] 第二方面，本发明提供一种过滤室，所述过滤室包括装在外罩里的微型过滤器，其 中，所述过滤器的表面和/或所述外罩的内表面通过气相沉积、升华、气相表面反应或粒子 溅射进行修饰，从而产生均一的涂层。在一些实施例中，所述过滤室包括前室和过滤后亚 室。在一些实施例中，所述前室包括上部过滤器，由此产生上室。在一些实施例中，所述上 部过滤器的表面通过气相沉积、升华、气相表面反应或粒子溅射进行修饰，从而产生均一的 涂层。在一些实施例中，所述修饰通过物理的气相沉积。在一些实施例中，所述修饰通过等 离子体增强的化学气相沉积。在一些实施例中，所述气相沉积采用金属氮化物或金属卤化 物。在一些实施例中，所述金属氮化物为氮化钛、氮化硅、氮化锌、氮化铟和/或氮化硼。在 一些实施例中，所述修饰通过化学气相沉积。在一些实施例中，所述化学气相沉积采用聚对 二甲苯或其衍生物。在一些实施例中，所述聚对二甲苯或其衍生物选自聚对二甲苯、聚对二 甲苯-N、聚对二甲苯-D，聚对二甲苯AF-4、聚对二甲苯SF及聚对二甲苯HT组成的组。在一 些实施例中，所述修饰通过聚四氟乙烯（PTFE)。在一些实施例中，所述修饰通过非晶形的特 氟隆或特氟隆AF。在一些实施例中，所述修饰通过全氟化碳。在一些实施例中，所述全氟 化碳为1H，1H，2H，2H-全氟辛基三乙氧基硅烷、1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷、三氯 (1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷或三氯（十八烷基）硅烷并且是液体的形式。在一些实施 例中，所述过滤器和/或外罩包含硅、二氧化硅、玻璃、金属、碳、陶瓷、塑料或多聚物。在一 些实施例中，所述过滤器和/或外罩包含氮化硅或氮化硼。
[0016] 第三方面，本发明提供一种过滤室，所述过滤室包括装在外罩里的微型过滤器，其 中，所述过滤器的表面和/或所述外罩的内表面通过金属氮化物、金属卤化物、聚对二甲苯 或其衍生物、聚四氟乙烯（PTFE)、特氟隆AF或全氟化碳修饰。在一些实施例中，所述过滤 室包括前室和过滤后亚室。在一些实施例中，所述前室包括上部过滤器，由此产生上室。在 一些实施例中，所述上部过滤器的表面通过金属氮化物、金属卤化物、聚对二甲苯或其衍生 物、聚四氟乙烯（PTFE)、特氟隆AF或全氟化碳修饰。在一些实施例中，所述金属氮化物为 氮化钛、氮化硅、氮化锌、氮化铟和/或氮化硼。在一些实施例中，所述聚对二甲苯选自聚 对二甲苯、聚对二甲苯-N、聚对二甲苯-D，聚对二甲苯AF-4、聚对二甲苯SF及聚对二甲苯 HT组成的组。在一些实施例中，所述全氟化碳为1H，1H，2H，2H-全氟辛基三乙氧基硅烷、 1H，1H，2H，2H-全氟癸基三乙氧基硅烷、三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷或三氯（十八 烷基）硅烷，并且所述全氟化碳共价结合在所述表面上。在一些实施例中，所述过滤器和/ 或外罩包含硅、二氧化硅、玻璃、金属、碳、陶瓷、塑料或多聚物。在一些实施例中，所述过滤 器和/或外罩包含氮化硅或氮化硼。
[0017] 本发明还提供一种过滤室，所述过滤室包括装在外罩里的微型过滤器，其中过滤 室包括前室和过滤后亚室，前室的液体流道大体上与过滤后亚室的液体流道相对，其中所 述过滤器的表面和/或所述外罩的内表面通过气相沉积、升华、气相表面反应或粒子溅射 进行修饰，从而产生均一的涂层。此外，本发明提供一种过滤室，所述过滤室包括装在外罩 里的微型过滤器，其中过滤室包括前室和过滤后亚室，前室的液体流道大体上与过滤后亚 室的液体流道相对，其中所述过滤器的表面和/或所述外罩的内表面通过金属氮化物、金 属卤化物、聚对二甲苯、聚四氟乙烯（PTFE)、特氟隆AF或全氟化碳修饰。在一些实施例中， 这里提供的过滤室可以包括至少两个微型过滤器。在一些实施例中，所述至少两个微型过 滤器串联排列。此外，本发明还提供一种过滤室，所述过滤室包括至少两个这里公开的串联 排列的过滤室。在一些实施例中，所述至少两个过滤室的前室是液体连通的。在一些实施 例中，所述至少两个过滤室共用一个微型过滤器和/或上部过滤器。在一些实施例中，每个 过滤室中的过滤器的狭缝具有不同宽度，所述过滤室按照狭缝宽度递增的顺序排列。
[0018] 第四方面，本发明提供一种包含这里公开的过滤室的筒。在一些实施例中，所述筒 包括至少两个过滤室。在一些实施例中，所述筒包括八个过滤室。
[0019] 第五方面，本发明提供一种用于分离液体样品中目标成分的自动过滤装置，包括 这里公开的过滤室。在一些实施例中，所述自动过滤包含控制过滤室中液体流的控制算法。 在一些实施例中，所述自动过滤装置包括至少两个过滤室。在一些实施例中，所述至少两个 过滤室串联排列，所述过滤室包括狭缝宽度递增的过滤器。在一些实施例中，所述过滤器包 含沿着液体流道递增的狭缝宽度。在一些实施例中，所述过滤室包括上室。在一些实施例 中，所述过滤后亚室包括多个隔板，每个隔板包含一个流出口。在一些实施例中，所述过滤 后室的每个隔板的流出口与一个多孔板的单个孔对准。在一些实施例中，所述孔间隔大约 每I-IOOmm,例如，大约每2. 25mm ;大约每4. 5mm，或大约每9或18mm。在一些实施例中，所 述自动过滤装置包括八个过滤室。在一些实施例中，所述自动过滤装置包含在过滤室中产 生流体流动的方法。在一些实施例中，所述产生流体流动的方法为液体泵。在一些实施例 中，所述自动过滤装置包含收集分离的目标成分的部件方法。
[0020] 第六方面，本发明提供用于从液体样品中分离和分析目标成分的自动系统，所述 自动系统包括这里公开的自动过滤装置以及与过滤装置连接的分析仪器。在一些实施例 中，所述分析仪器是细胞分选设备。在一些实施例中，所述分析仪器是流式细胞仪。
[0021] 第七方面，本发明提供一种从液体样品中分离目标成分的方法，包括：a)将液体 样品分配进这里公开的过滤室；和b)提供通过过滤室的液体样品的液体流，其中液体样品 的目标成分被过滤器保留或通过过滤器。在一些实施例中，所述方法包括提供通过过滤室 前室的液体样品液体流和通过过滤室过滤后亚室的溶液的液体流，以及选择性地提供通过 过滤室上室的溶液的液体流。在一些实施例中，基于成分的大小、形状、可塑性、亲和力和/ 或结合专一性分离所述液体样品。在一些实施例中，所述液体样品通过前室的流入口进行 分配。在一些实施例中，将所述溶液引入过滤后亚室的流入口。在一些实施例中，将所述溶 液引入上部过滤室的流入口。在一些实施例中，通过过滤器外部结构和/或过滤器