一种多重近红外荧光增强生物芯片筛选循环肿瘤细胞方法与流程

本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及多重近红外荧光增强筛选循环肿瘤细胞，更具体地，本发明涉及用于富集循环肿瘤细胞的微流控装置、用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒、富集循环肿瘤细胞的方法、对循环肿瘤细胞进行检测的系统以及对循环肿瘤细胞进行检测的方法。

背景技术：

液体活检由于其非侵入性和精确诊断的特点,其在临床研究和生物医学检测中具有巨大的前景。特别地，对患者血液中的循环肿瘤细胞(ctc)的分析在更好地管理多种癌症中起着至关重要的作用。与常规方法包括活检和成像方法不同，ctc可在精确筛选、治疗评估、患者分期、癌症疾病的转移/复发研究中提供新的见解和机遇。然而，对ctc的富集和下游分析是非常具有挑战性的，因为它们在血液中的丰度极低，通常一个ctc混合在数十亿的其他血细胞中。为了在临床中构建高性能ctc测定方法，需要考虑以下方面，包括：i)捕获ctc的富集方法；ii)检测ctc的分析方法；iii)实际应用处理患者血液；iv)实验室自动化大规模使用。解决上述方面的新工具是非常需要的，并且需要合理设计的材料和装置。

等离子体材料通常指的是贵金属(例如金)及其复合物，其在特定波长范围内的光照下具有独特的表面等离子体共振效应。因为具有特定的结构和表面化学性质，这种等离子体材料在近红外区(nir-fe，650-1700nm)具有荧光增强效应，通过微印刷技术在这种材料上固定特定的蛋白探针,可实现生物标志物的nir-fe疾病诊断。值得注意的是，当前的等离子体激元芯片仅与微阵列技术集成，并且尚未被引入用于高级诊断的其他微/纳米装置。同时，尽管在芯片上nir-fe分子检测的成功，另一个挑战是芯片上的细胞检测，之前的工作仅由于等离子体体芯片本身的增强效果，但是缺乏用于稀有细胞(例如ctc)分析的操作和多重nir荧光增强步骤，其仅可提供有限的增强效果(2-30倍)。

因此，开发设计器件使其与芯片上nir-fe细胞检测整合，并克服本领域中所提及的主要障碍具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本申请中，发明人第一次展示了等离子体金芯片的多重增强nir荧光应用于ctcs筛选。发明人将ctc的微流体免疫磁性富集与芯片上nir-fe检测结合。通过细胞富集的操作和其形态改变，发明人观察到约50-122倍的多重nir荧光增强，优于其他芯片的检测效果。发明人对捕获的ctc上的多个蛋白生物标志物进行检测，并将该方法应用于在添加标准细胞和癌症患者血样的检测。本申请的工作不仅有助于高级ctc分析在临床上的有效癌症管理，而且有助于等离子体材料/设备和细胞之间的界面的生物分析应用设计。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于富集循环肿瘤细胞的微流控装置。根据本发明的实施例，所述装置包括：本体，所述本体内限定出上方开口的流体流动空间；进样口，所述进样口设置在所述本体的底部；出样口，所述出样口设置在所述本体的底部；等离子体荧光增强芯片，所述等离子体荧光增强芯片设置在所述流体流动空间的所述上方开口，所述等离子体荧光增强芯片的下表面负载有抗体；磁场发生组件，所述磁场发生组件设置在所述等离子体荧光增强芯片的上表面。利用根据本发明实施例的微流控装置，可以实现循环肿瘤细胞的简易分离和高效捕获和富集，并且能够对富集到的富集循环肿瘤细胞的进行nir增强荧光的高灵敏检测。发明人发现，在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下等离子体荧光增强芯片(pgold)多重nir荧光增强约50-122倍，远高于其他芯片检测的两个数量级和现有技术的最佳报道。

根据本发明的实施例，上述微流控装置还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述磁场发生组件为磁铁。

根据本发明的实施例，所述等离子体荧光增强芯片可拆卸地设置在所述流体流动空间的所述上方开口。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子适于从所述血液中捕获循环肿瘤细胞；前面所述的用于富集循环肿瘤细胞的微流控装置。利用根据本发明实施例的试剂盒，可以实现循环肿瘤细胞的简易分离和高效捕获和富集，并且能够对富集到的富集循环肿瘤细胞的进行nir增强荧光的高灵敏检测。发明人发现，在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下等离子体荧光增强芯片(pgold)多重nir荧光增强约50-122倍，远高于其他芯片检测的两个数量级和现有技术的最佳报道。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述磁性纳米粒子表面负载有循环肿瘤细胞特异性标记分子。进而可实现样本(如血液样本)中循环肿瘤细胞的特异性标记，利用根据本发明实施例的试剂盒对循环肿瘤细胞的富集效率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述特异性标记分子为抗epcam。具体地，所述磁性纳米粒子(mnps)为用上皮细胞粘附分子抗体(抗epcam)功能化的磁性纳米粒子(mnps)，进而进入所述流体流动空间的循环肿瘤细胞会在重力和磁场力(mnps)的组合作用选择性富集在离子体荧光增强芯片的表面。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种利用前面所述的试剂盒富集循环肿瘤细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将含有循环肿瘤细胞的样品与所述磁性纳米粒子混合，以便形成磁性纳米粒子-循环肿瘤细胞复合体；(2)将所述混合物经由所述微流控装置的进样口进入所述流体流动空间，并从所述出样口排出所述流体流动空间，其中，所述磁性纳米粒子-循环肿瘤细胞复合体在所述磁场发生组件的作用下富集在所述等离子体荧光增强芯片的下表面。利用根据本发明实施例的方法，可以实现循环肿瘤细胞的简易分离和高效捕获和富集，并且能够对富集到的富集循环肿瘤细胞的进行nir增强荧光的高灵敏检测，在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下等离子体荧光增强芯片(pgold)多重nir荧光增强约50-122倍，远高于其他芯片检测的两个数量级和现有技术的最佳报道。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种对循环肿瘤细胞进行检测的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：前面所述的装置；和荧光检测设备。利用根据本发明实施例的系统，可以实现循环肿瘤细胞的简易分离和高效捕获和富集，并且能够对富集到的富集循环肿瘤细胞的进行增强荧光的高灵敏检测。

根据本发明的实施例，上述系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述荧光检测设备为nir荧光检测设备。发明人发现，在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下的等离子体荧光增强芯片(pgold)多重nir荧光增强约50-122倍，利用nir荧光检测设备，系统对ctc的检测的灵敏度显著提高。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种对循环肿瘤细胞进行检测的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：按照前面所述的方法，对样本中的循环肿瘤细胞进行富集，以便获得富集有所述循环肿瘤细胞的等离子体荧光增强芯片；利用nir荧光检测设备对所述等离子体荧光增强芯片富集的所述循环肿瘤细胞进行目标分子检测。利用根据本发明实施例的方法，可以实现富集循环肿瘤细胞的nir增强荧光的高灵敏检测，在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下的等离子体荧光增强芯片(pgold)多重nir荧光增强约50-122倍，远高于其他芯片检测的两个数量级和现有技术的最佳报道。

本申请所提出的用于富集循环肿瘤细胞的技术，这项技术的核心基于等离子体荧光增强芯片的上述微流控装置。

附图说明

图1是根据本发明实施例的富集循环肿瘤细胞的微流控装置示意图；

图2是根据本发明实施例的对循环肿瘤细胞进行检测的系统示意图；

图3是根据本发明实施例的ctc筛选设备图，

其中，a为筛选过程和装置的示意图(上)和横截面视图(下)；b显示pgold芯片与模块(左)的整合的数字图像和pgold芯片(右)的sem图像；c显示了pgold芯片上ctc的生物标志物蛋白的nir荧光检测的示意图，rbc是指红细胞，对于b插图中的sem图像，比例尺是500nm；

图4是根据本发明实施例的mnp的表征结果，

其中，a位sem，b位tem和c为mnp的磁滞曲线。d为通过磁体磁性分离(从胶体悬浮液)mnp，比例尺分别为a)200nm和b)100nm；

图5是根据本发明实施例的pgold芯片的消光光谱与irdye680和irdye800的激发(线)和发射(阴影区)区域重合；

图6是根据本发明实施例的多重nir荧光增强结果图，

其中，富集ctc的nir荧光(通过irdye800标记)图像(上部，插图显示明场视野图像)和平均荧光强度(下部)，包括芯片上的a)mcf-7，b)skbr-3和c)colo-205，所使用的芯片包括(i)玻璃芯片，(ii)sgold芯片，(iii)没有免疫磁性富集的pgold芯片和(iv)具有免疫磁性富集的pgold芯片。对于a-c)中的所有荧光图像，比例尺为10μm；

图7是根据本发明实施例的ctc的扫描荧光图像，

其中，记录在芯片上的a)mcf-7，b)skbr-3和c)colo-205的nir荧光(irdye800)图像，所使用的芯片包括(i)玻璃芯片，(ii)sgold芯片，(iii)没有免疫磁性富集的pgold芯片和(iv)具有免疫磁性富集的pgold芯片。对于a-c)中的所有荧光图像，比例尺为100μm；

图8是根据本发明实施例的没有和具有磁性富集的ctc的尺寸，

其中，在没有和具有磁性富集的pgold芯片上的ctc的平均尺寸，包括mcf-7，skbr-3和colo-205。黑色和灰色分别表示没有和具有磁性富集的ctc的平均尺寸，分析三个细胞以计算作为误差条的标准偏差(s.d.)，数据显示为平均值±s.d。(n＝3)；

图9是根据本发明实施例的多重增强的机制结果图，

其中，a)示意图，显示(i)在没有免疫磁性富集下，ctc(mcf-7)的增强的nir荧光和(ii)在pgold芯片上具有免疫磁性富集的ctc的多重增强nir荧光。b)ctc的侧视和c)顶视sem图像，(i)没有免疫磁性富集和(ii)在pgold芯片上具有免疫磁性富集。比例尺在b)和c)中为5μm；

图10是根据本发明实施例的生物标志物的多重分析结果图，

其中，a)玻璃芯片和b)pgold芯片上的ctc(mcf-7)的荧光显微镜图像，c)玻璃芯片和d)pgold芯片的荧光上的ctc(mcf-7)扫描图像。左：抗egfr的irdye680通道；中间：抗ck的irdye800通道；右：两个通道的合并结果。a)在右侧的插图显示明场图像。在a)和b)中，比例尺分别为10μm；

图11是根据本发明实施例的ctc的捕获效率结果图，

其中，a)捕获的ctc的鉴定，其显示捕获的ctc(mcf-7)的(i)明场，(ii)dapi标记，(iii)抗ck标记，和(iv)三者合并的荧光图像，在(i)pbs溶液和(ii)全血中的b)mcf-7，c)skbr-3和d)colo-205的捕获效率。进行五个独立实验以计算标准偏差，并且显示的数据通过5次计算的平均值±s.d显示在图上(n＝5)，a)中的比例尺为10μm；

图12是根据本发明实施例的来自多个细胞的两种生物标志物的扫描荧光分析结果图，

其中，通过nir荧光扫描仪在a)玻璃芯片和b)pgold芯片上捕获的多个ctc(mcf-7)的多重生物标志物分析。左：抗egfr的irdye680通道；中间：irdye800通道为抗ck；右：两个通道的合并结果，比例尺在a)和b)中为20μm。

图13是根据本发明实施例的捕获ctc的鉴定结果图，

其中，在pgold芯片上捕获的a)skbr-3和b)colo-205的(i)明场，(ii)dapi标记，(iii)抗ck标记，比例尺在a)和b)中为10μm；

图14是根据本发明实施例的癌症患者中ctc的筛选结果图，

其中，a为来自11个癌症患者的5ml全血中芯片上捕获的ctc的数量；b显示来自患者1(肺癌)的一个白细胞(cd45+/dapi+/ck-，上)和一个捕获的ctc(cd45-/dapi+/ck+，下)的鉴定的荧光图像，比例尺在b)中为5μm；以及

图15是根据本发明实施例的癌症患者中ctc的鉴定结果图，

其中，三色荧光方法显示来自患者5的一个白细胞(左上，cd45+/dapi+/ck-)荧光图像和一个捕获的ctc(右下，cd45-/dapi+/ck+)荧光图像：a)抗-cd45的fitc通道，b)抗-ck的irdye800通道，c)细胞核的dapi通道和d)合并通道，图a-d中的比例尺为10μm。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

一方面，本发明提出了一种用于富集循环肿瘤细胞的微流控装置。根据本发明的实施例，参考图1，该装置1000包括：本体100，本体100内限定出上方开口的流体流动空间；进样口200，进样口200设置在本体100的底部；出样口300，出样口300设置在本体的底部；等离子体荧光增强芯片400，等离子体荧光增强芯片400设置在流体流动空间的上方开口，等离子体荧光增强芯片400的下表面负载有抗体；磁场发生组件500，所述磁场发生组件设置在等离子体荧光增强芯片400的上表面。具体地，磁场发生组件500为磁铁。等离子体荧光增强芯片400可拆卸地设置在流体流动空间的上方开口。

另一方面，本发明提出了一种对循环肿瘤细胞进行检测的系统。根据本发明的实施例，参考图2，该系统包括：前面所述的装置1000；和荧光检测设备2000。具体地，荧光检测设备2000为nir荧光检测设备。

利用根据本发明实施例的微流控装置和系统，可以实现循环肿瘤细胞的简易分离和高效捕获和富集，并且能够对富集到的富集循环肿瘤细胞的进行nir增强荧光的高灵敏检测。在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下等离子体荧光增强芯片(pgold)多重nir荧光增强约50-122倍，远高于其他芯片检测的两个数量级和现有技术的最佳报道。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本实用新型，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下实验中，所用的具体方法和材料如下所述：

芯片制备

制备三种类型的芯片，包括等离子体金(pgold)芯片，溅射金(sgold)芯片和玻璃芯片。在优化的溶液中通过种子法合成具有丰富纳米岛的pgold芯片。简言之，将载玻片在剧烈搅拌下浸入haucl4(5mm)和nh4oh(20μl/ml，0.6％,v％)溶液中20分钟。将获得的载玻片依次浸入两次水浴中洗涤。洗涤后，将au离子接种的载玻片在室温下放入硼氢化钠(1mm)溶液中1分钟以进行还原，并通过依次浸入两次水浴中进行洗涤。将这些载玻片转移到摩尔比为1:1的另一haucl4和nh4oh混合溶液中，用于au膜的继续生长。生长过程在室温下强烈摇动(100rpm)20分钟，并洗涤以得到最终的pgold芯片。将pgold芯片在室温下储存在可密封的容器中。

sgold芯片通过磁控溅射方法制备(gsl-1100x-spc-16m，沈阳科晶自动化设备有限公司)。金靶(99.99％)购自上海大恒光学精密机械有限公司。溅射过程在真空(10pa)下以20ma进行2分钟。sgold芯片在室温下储存在可密封的容器中。

玻璃片从中国国药集团化学试剂有限公司购买。将载玻片浸入15mlpiranha溶液(3/1，v/v，浓硫酸(质量分数95％)和过氧化氢(质量分数30％)中5分钟以除去有机残留物，用纯水洗涤三次并保持在室温。

微流控装置构建

微流体装置的关键部件包括芯片模块，流体泵(19*13*6.2mm，350-400mt，42.8*42.3*48.3mm)，样品管(15ml离心管，美国bd公司)，磁棒(19*13*6.2mm，350-400mt)和控制系统由中国宁波美晶医疗技术有限公司统一提供。集成芯片的模具以聚丙烯制作并且采用优化的尺寸和布局而设计。用微流泵驱动管道中的空气流以调节液体流速(1ml/h)。

磁性纳米颗粒制备

磁性纳米颗粒(mnp)用上皮细胞粘附分子抗体(epcam抗体)功能化，以便于细胞的免疫磁性富集。链霉亲和素标记的mnp购自micromod公司(罗斯托克，德国)。我们通过链霉亲和素与生物素之间的特异性相互作用合成了epcam抗体功能化的免疫磁性纳米颗粒。简言之，mnp用50mm磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph＝7.4,50mm)洗涤两次，在37℃下将mnp与抗体的混合物振荡1.5小时，使其与生物素化的epcam抗体(abcaminc.，cambridge，usa)(100:1，w/w)充分反应。再用50mmpbs(ph＝7.4)洗涤两次后，通过离心(200g，5分钟)和磁力除去游离的epcam抗体。将所得功能性mnp重悬浮于含有3％牛血清白蛋白(bsa，sigma)的50mmpbs(ph＝7.4)缓冲液中，用于封闭并在4℃下储存。

材料和设备表征

材料和器件的表征包括透射电子显微镜(tem)、扫描电子显微镜(sem)、磁滞分析、紫外可见(uv)光谱、数字图像和视频。数字图像和视频由nikond7100拍摄获得。uv光谱通过aucyuv1901pc分光光度计测量。通过jeoljem-2100ftem仪器在10kv下拍摄tem图像。将10μl乙醇(0.1μg/ml)颗粒悬浮液滴到铜网上，待样品风干之后进行tem观察。10kv下通过hitachis-4800进行sem分析。将颗粒悬浮液滴在硅晶片上并在室温下干燥后，在sem装置中直接观察。使用振动样品磁强计(quantumdesign，physicalpropertymeasurementsystem)测量磁滞回线(使磁场在-50和50koe之间循环)。

细胞培养

使用报道的方案培养三种细胞，包括mcf-7(人乳腺癌细胞系，epcam阳性)，skbr-3(人乳腺癌细胞系，epcam阳性)和colo-205(人结肠癌细胞系，epcam阳性)。所有细胞来自中国科学院(上海细胞资源中心研究所)，并在37℃下潮湿的5％co2培养箱中培养。将mcf-7细胞培养在eagle(sigma)培养基中。将skbr-3细胞培养在dulbecco改良的eagle培养基(dmem，sigma)中。colo-205细胞培养在roswellparkmemorialinstitute培养基(rpmi-1640)中。为了获得游离细胞，将1ml胰蛋白酶(0.25％，v/v)滴入细胞培养瓶中，在co2培养箱中消化5分钟，并将获得的细胞保存于pbs(ph＝7.4，50mm)缓冲液。

标准添加实验

将上述三种细胞系(mcf-7，skbr-3和colo-205)分别添加到50mmpbs(ph＝7.4)溶液和全血中，以测量我们方法的捕获效率。全血样品由健康志愿者捐献。简言之，将6-200个细胞添加至5mlpbs(ph＝7.4,50mm)溶液和全血中。基于捕获细胞(n)和加标细胞(n)的数量，通过免疫磁性富集和计数荧光分析计算捕获效率(n/n)。

ctc的免疫磁性富集

为了进行免疫磁性富集，将30μg的功能化mnp与生物混合物(5ml加标样品或患者血液)在37℃下温育1.5小时以选择性地标记ctc。将上述混合物加入到微流体装置的样品管中，其与芯片加载模块连接。流速为1ml/h，需要～5h完成富集。将标记为ctc的mnp在磁场中(从磁体)附着于芯片的表面，并连续用含有0.05％tween-20(pbst)的pbs(ph＝7.4，50mm)洗涤三次。将所得芯片用冰丙酮溶液(99％，v％)避光处理15分钟，并在4℃下储存。

近红外荧光染料标记抗体

用荧光染料(irdye800/680)标记ck检测抗体和egfr检测抗体。抗体通过edc/nhs反应(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺)与irdye800/680标记。将irdye680-nhs/irdye800cw-nhs酯(licorbiosciences)溶于无水二甲基亚砜中，并在使用前在-20℃避光保存。将抗体和染料以1:4的摩尔比混合并在黑暗中置于振荡器上1.5小时。使用nap-5柱(gehealthcare)除去未偶联的染料并纯化标记的抗体。将edc/nhs反应后的原料混合物加入到具有10mlpbs(ph＝7.4，50mm)的柱中。收集含有标记抗体的洗脱液，并在-20℃下在避光条件下储存。

芯片在线染色

为了对附着在细胞表面的生物标志物蛋白进行染色，用pbst清洗芯片三次，随后在37℃下在黑暗中与染料标记的检测抗体(250μl，5μg/ml)孵育1.5小时。然后，将染色的芯片用pbst洗涤三次，以除去杂质。为了染色细胞核，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，5mg/ml)染色15分钟，然后用pbst(ph＝7.4，50mm，0.05％tween-20)洗涤三次。所获得的芯片在近红外成像和扫描之前储存在4℃。

扫描电镜和显微镜成像

通过扫描和显微镜成像对芯片上的细胞进行检测和鉴定。innopsys扫描仪(innoscan710)用于扫描芯片，从而对细胞成像。所有实验的扫描分辨率设置为3μm/像素。通过nis-elementsbr4.51.00(eclipseti-e相关软件，nikon)分析荧光扫描图像，荧光强度高达65536。具有特异性滤色片的eclipseti-e(nikon)荧光显微镜(对于dapi，异硫氰酸荧光素(fitc)，irdye680/800)用于记录细胞的显微镜成像。

癌症患者的ctcs分析

收集来自癌症患者的5ml全血并用于芯片ctc捕获。项目启动时已获得患者的知情和同意。根据国家综合癌症网络(nccn)指南诊断癌症患者。排除了诸如活动性出血等医学状况。通过具有形态学分析的荧光染色结果(cd45-/dapi+/ck+)鉴定ctc，并对癌症患者的ctcs数目计数。本工作的所有研究方案均经宁波第二医院机构伦理委员会和上海交通大学生物医学工程学院批准。

以下将详细描述本发明的实验过程和结果：

ctc筛选设备的设计

发明人设计了一种微流体装置来进行芯片上ctc的免疫磁性富集，如图3a所示。发明人使用正向富集方法，用上皮细胞粘附分子抗体(抗epcam)功能化的磁性纳米粒子(mnps)标记患者血液或添加标准细胞中的ctcs。根据图4a，4b中的扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)分析，功能化的mnp具有～25-40nm的平均尺寸，饱和磁化值为～0.9emu/g(循环场在-50和50koe之间，图4c)没有余留磁性，可在1分钟内用磁铁快速分离(图4d)。然后发明人将生物混合物通过泵压入微流体通道，并通过重力和磁场力的组合作用选择性富集ctc，并用于最终检测。

芯片上的集成和检测

发明人的器件的一个重要特点是易于集成和使用多种芯片进行检测，如图3b所示.为了与芯片集成，发明人开发了无泄漏的微流体密封模块，以可拆卸的方式附着在芯片表面上(图3b，左)。发明人通过一种可控的溶液种子生长法制备了等离子体金(pgold)芯片，sem观察到芯片上分布着岛间距离(图3b，右)约10nm的独特形态金纳米岛。对于芯片上的检测，pgold芯片的特点是在其吸收/消光光谱(图5)中的nir区域中可提供等离子体共振。发明人用nir荧光染料(irdye800/680)标记富集ctc的生物标记蛋白用于芯片上分析(图3c)。

芯片上ctc的nir-fe检测

发明人在选定的芯片(图6，7)上进行了三种类型的ctc(mcf-7、skbr-3和colo-205)的nir-fe检测，包括玻璃芯片、溅射金(sgold)芯片和pgold芯片(具有和不具有免疫磁性微流体富集)。如图6a所示，对于mcf-7，玻璃芯片和sgold提供非常弱的信号，平均荧光强度分别为637和1456，这是由于没有nir-fe检测或芯片表面上存在荧光猝灭。为了比较，发明人使用没有磁性富集的pgold芯片实现细胞的nir-fe检测，产生平均荧光强度5136，与玻璃芯片上的荧光强度相比增加了8.1倍。

值得注意的是，对于磁性富集，发明人观察到细胞大小增加了30.4％(从～136.4至～177.9μm²，图8)，并进一步增强ctc的nir荧光信号，与玻璃芯片相比，可提供平均荧光强度32540和增强因子51.1倍(与减去背景信号相比增强55.3倍)。发明人使用skbr-3和colo-205进行检测时，也发现类似的结果，它们分别62.2倍(减去的背景信号为69.1倍，图6b)的增强因子和95.3倍增强因子(减去的背景信号为122.0倍，图6c)。发明人在表1-3中总结了这些结果，并且证实了pgold芯片上的多重nir荧光增强(51.1-122.0倍)检测。

表1，mcf-7的平均荧光强度分析：

表2，skbr-3的平均荧光强度分析：

表3，colo-205的平均荧光强度分析：

多重增强的机制

发明人提出了多重nir荧光增强检测的机制，并进行了sem的表征(图9)。常规的细胞nir-fe检测缺乏细胞形态的操作和细胞与pgold芯片表面之间的平均距离的优化。相比之下，发明人在免疫磁性微流体富集过程中通过磁力压缩细胞，并减少细胞与pgold芯片表面之间的平均距离，其结果导致多重增强效应(图9a)。如图9b所示，pgold芯片的侧视sem图像分别显示了没有和具有磁性分离的细胞的正常和压缩的形态(减少的厚度约为2μm)。此外，在俯视sem中，发明人还发现由于压缩过程，细胞尺寸增加，这与侧视sem和先前的荧光成像结果(图9，图8)一致，验证了所提出的多重增强机制。

多重蛋白标记分析

发明人通过irdye680和irdye800通道展示了ctc的多重蛋白质生物标志物分析(图10)。发明人分别在irdye800和irdye680通道上检测到癌细胞的两种蛋白质生物标志物，包括细胞角蛋白(ck)和表皮生长因子受体(egfr)。发明人通过pgold芯片上的显微镜观察到清晰的细胞图像(图10a中的单细胞分析和图11中的多细胞分析)，优于两个通道中的玻璃芯片上的结果。值得注意的是，发明人还通过微扫描对芯片上富集的ctc进行了成像(图10b中的单细胞分析和图12中的多个细胞分析)，其结果与显微镜观察到的一致，并且发明人这种技术可能在实际的稀有细胞分析过程中具有更大的检测高通量和易于操作等有利于大规模自动化应用的优点。

捕获效率和识别

发明人通过一系列添加标准细胞的实验研究了发明人的设备对ctc的捕获效率(图11)。发明人通过图11a中的荧光染色鉴定了富集的ctc，并展示了一个ctc的典型图像。发明人将6-200mcf-7掺入标准溶液(图11b-i)或全血(图11b-ii)中，并计数富集的ctc的数量。捕获效率在标准溶液中达到86.9％，在全血中达到81.4％。在检测另两种类型的细胞(包括skbr-3(图11c，13a)和colo-205(图11d，13b))的过程中，发明人也观察到的类似结果。由于样品复杂性高，全血中的捕获效率相当或略低于(～5％)标准溶液的捕获效率。因此，发明人的方法展示了在各种低浓度ctc条件下可满足需求的捕获效率。

在癌症患者中的诊断应用

发明人将方法应用于从癌症患者血液中捕获ctc，以证明pgold芯片和设备的实际应用。使用已建立的方案，发明人从具有各种表型(包括乳腺癌，肺癌，胰腺癌和结肠直肠癌)的11名患者(图14a和表4)的5ml全血中捕获了1～20个ctc。基于cd45和ck的生物标志物分析以及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)荧光染色，图14b显示了一个白细胞(cd45+/dapi+/ck-)和一个经鉴定的ctc的典型单细胞荧光图像cd45-/dapi+/ck+)。发明人还通过多色荧光方法在图15中显示了典型的多细胞荧光图像用于ctc的鉴定。发明人在癌症患者的pgold芯片上实现了ctc的多重nir荧光增强筛选。

表4：

大量致力于癌症诊断的ctc分析研究工作已经开展。由于有效的特异性抗体识别，化学方法在富集ctc中提供高度的选择性和灵敏性，其在临床上具有较大的优势，这种临床诊断方法已被fda批准。值得注意的是，富集平台和下游检测对于基于抗体的ctc分析至关重要。不同于以前的ctc研究设计，通过pgold芯片我们合理组合了富集平台和下游检测。在本申请的工作中，微流体系统在简易分离的前提下提供了高捕获效率，更重要的是，能够集成多种芯片以便于简易的操作和高灵敏检测，并应用于进进一步的检测应用。

等离子共振材料和设备应用在近红外荧光增强检测可以解决生物医学应用领域内灵敏度低和低通量的难题。尽管在ctc诊断领域已取得了实质性的进展，但大多数当前的方法主要还是集中在材料的结构优化和特定生物标志物的选取。对分析目标(例如ctc)的操作仍然是困难的，且有待于进一步开发，这种技术的研究可能提供新的视野。发明人发现pgold芯片上的细胞形态学的变化，并反应在有ctc的微流体免疫磁性富集的条件下pgold多重nir荧光增强约50-122倍，高于其他芯片检测两个数量级和最佳报道。发明人的研究表明纳米/微观操作在生物分析领域的意义，其在目前的研究和实践中通常不被重视甚至被忽略。

在细胞成像和应用中，多重分析和实验室自动化对于大规模应用至关重要。在这项工作中，本申请展示了在两种nir荧光通道中的ck和egfr的多重分析用于潜在的细胞分型。同时，发明人对芯片上富集的ctc进行快速、自动化的微扫描，并且可以对记录图像进行数字信号处理，以进行非显微镜细胞分析。值得注意的是，发明人验证了该建立的方法在添加标准细胞实验和临床各种癌症类型的患者的ctcs分析中均可应用。考虑到上述优点，发明人预计将在医院应用于大规模的癌症管理和稀有细胞分析。

总之，发明人报道了癌症患者的ctc的多重nir荧光增强筛选。发明人的工作不仅推进了稀有细胞分析，包括但不限于ctc和癌症在生物医学领域，而且阐明以等离子共振材料或设备为主体和以细胞等为客体之间的接口的设计，以在不远的未来产生更好的应用平台和检测技术。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。