一种邻苯基查尔酮类化合物在荧光探针中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及英光探针领域，更具体地，涉及一种邻苯基查尔丽类化合物在英光探 针中的应用。
【背景技术】
[0002] 微管作为细胞骨架的主要组成成分，在维持细胞形态，细胞分裂，信号传导W及物 质运输等过程中起着重要的作用。细胞内微管一直处于高度动态的过程，不断的解聚成微 管蛋白和聚合成不同长度的微管，使得微管和游离的微管蛋白在细胞内维持着动态平衡的 状态，而且送种平衡状态会应细胞所需向微管或者微管蛋白方向移动，从而引起细胞在不 同应激状态下所含微管和微管蛋白的比例有所不同。有效检测细胞内微管与微管蛋白，对 研究特定条件下，微管蛋白及微管的功能与行为规律，W及临床诊断等方面，均具有重要的 意义。
[0003]目前已有用于监测微管的英光分子的报道。比如紫杉醇类化合物只能结合在微管 上，由紫杉醇衍生而出的英光分子（如BODIPYFLpaclitaxel,OregonGreen? 488Taxol) 可W用于对微管的定位和定量；而长春新碱类化合物也只能结合在微管阳极端点处，由长 春新碱衍生出的英光分子（B0DIPYFLVinblastine)也被报道可W用于对微管的定位和定 量；另外，微管蛋白特异抗体也常被用于免疫英光法对微管蛋白及微管进行显影分析。送些 英光分子的发现为细胞内微管的检测提供了有利的工具。但是，由于送些探针分子即可作 用于微管蛋白，也可作用于微管蛋白所形成的微管，因此无法对二者进行有效的区分。虽然 文献曾报道秋水仙碱可W特异性的结合于游离的微管蛋白，但该分子具有英光强度比较弱 的缺点；后来也发现了氣标记的秋水仙碱用于微管蛋白的定位和定量，但是送些分子的合 成比较繁琐而且放射元素标记具有危险性，使得其应用受到了限制。因此发现新的特异性 结合游离微管蛋白的英光分子具有迫切的需求。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一类英光探针，我们发现的送类英光分子既可W实现对游离微管蛋白 的识别和定量，同时也具有合成简单，英光性强，染色过程简易等优点。此外送类分子可W 用于其他与微管蛋白结合有关的实验，如筛选微管蛋白聚集抑制剂，同时可W用于研究细 胞内微管蛋白的分布与含量的变化，如用于不同肿瘤细胞和耐药细胞W及细胞EMT发生前 后微管蛋白分布和量的变化检测。
[0005] 本发明首先提供一种邻苯基查尔丽类化合物在英光探针中的应用，所述的苯基查 尔丽类化合物的结构式为
Ri为OH或H，Rz为-0邸3 或N(CH3)2,Ra为H或F，Ra为H或F。
[0006] 所述的英光探针为对微管蛋白进行特异性检测的探针。
[0007] 所述的应用为邻苯基查尔丽类化合物在制备肿瘤中的微管蛋白的英光探针中的 应用。如用于不同肿瘤细胞和耐药细胞W及细胞EMT发生前后微管蛋白分布和量的变化检 测。
[0008] 所述的应用为邻苯基查尔丽类化合物对游离微管蛋白的识别和定量检测。
[0009] 所述的英光探针用于细胞体外和/或细胞体内的微管蛋白的检测。
[0010] 所述的英光探针用于筛选可与微管蛋白结合的分子。
[0011] 所述的英光探针用于制备微管蛋白检测试剂。
[0012] 本发明的英光探针本身只具有微弱的英光，但当与微管蛋白结合后，产生强英光 发射，并具对微管蛋白具有浓度依赖性；同时，本发明提供的分子，与细胞内其它小分子，生 物大分子W及由微管蛋白所形成的微管，不发生明显的英光增强现象，具有优良的选择性。 可用于生物体系中微管蛋白的特异性检测，显像，W及与之相关的临床诊断。
[0013] 本发明具有W下用处： 1. 用于体外模型中微管蛋白的特异性检测、显像与变化规律研究； 2. 用于细胞内微管蛋白的特异性检测、显像与变化规律研究； 3. 用于肿瘤细胞内微管蛋白的特异性检测、显像与变化规律研究； 4. 用于涉及到细胞内微管蛋白的特异性检测、显像与变化规律研究的临床诊断。
[0014] 本发明涉及的英光探针具有W下优点： (1) 合成路线简单，容易获得，该类英光分子制备方法已公布在申请的专利中（【申请号】 201410032845. 9)； (2) 具有长的英光发射波长（〉500nm)能够有效避免来自生物大分子背景英光的干扰； (3) 该探针分子本身无英光，只有与微管蛋白结合后才具有很强的英光，因此检测信噪 比高，灵敏度高； (4) 具有优秀的选择性，能够排除细胞内其他蛋白的干扰，并且对聚合的微管亲和性比 较弱，因此可W特异性检测游离微管蛋白，从而具有检测EMT等不同生理过程的潜力； (5) 具有良好的生物膜通透性，因而不仅能用于固定的细胞还可W用于活细胞中微管 蛋白的检测； (6)稳定性高，不受生理环境中抑值的影响，在抑=2-10之间，英光探针和微管蛋白结 合后，英光强度不受明显影响。
【附图说明】
[0015]图1为英光分子探针与微管蛋白结合引起的英光发射。
[0016] 图2为英光分子探针与微管蛋白结合的特异性和稳定性。
[0017]图3为英光分子探针用于检测与微管蛋白秋水仙碱结合位点的竞争性结合。
[0018] 图4为英光分子探针用于对肿瘤细胞及其耐药株中微管蛋白的定位，W及与微管 蛋白抗体免疫英光结果的比较。
[0019] 图5为英光分子探针用于检测肿瘤细胞及其耐药株中微管蛋白的分布和量的变 化。
[0020] 图6为英光分子探针用于检测细胞上皮-间质转换（EMT)前后微管蛋白H维结构 上的分布和量的变化。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用 的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0022] 英光探针1;Ri为0H，Rz为0邸3,Rs为H，Ra为F。
[002引英光探针2;Ri为0H，Rz为0邸3,Rs为F，Ra为H。
[0024]英光探针3 ;Ri为H，Rz为N(CHs) 2,Rs为H，Ra为F。
[00幼英光探针4 ;Ri为H，Rz为N(CHs) 2,Rs为F，Ra为H。
[0026]实施例1英光分子探针与微管蛋白结合引起的英光发射W及英光光谱性质 将不同英光分子探针与微管蛋白混合在微管蛋白工作液中（80禮PIPESpH6.9，2.0 mlMgC12,and0. 5mlEGTA)，37°C赔育30min后，于37°C多功能酶标仪上波谱扫描模式 下对英光分子-微管蛋白结合后的英光激发和发射波长进行测定，先固定激发波长Ex=365 nm，对发射波长Em进行扫描，W确定最佳发射波长，然后固定发射波长Em为最佳发射波长， 对激发波进行扫描，W确定最佳激发波长。将不同英光分子探针与微管蛋白混合在微管蛋 白工作液中，在最佳激发和发射波长下，对英光探针与微管蛋白结合引起的英光动力学进 行测定。结果如图1所示，发现英光探针1和2的最佳激发波长约为365nm，最佳发射波长 为约465nm，而英光探针3和4的最佳激发波长约为430nm，