制备具有高效肿瘤杀伤性dc-cik免疫细胞的方法及制得的dc-cik免疫细胞的利记博彩app
【专利说明】制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法及制得的
DC-CIK免疫细胞
技术领域
[0001]本发明涉及一种制备DC-CIK免疫细胞的方法，尤其是一种制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法及制得的DC-CIK免疫细胞。
【背景技术】
[0002]DC-CIK联合免疫细胞，全称是细胞因子激活的杀伤细胞-树突状细胞混合疗法。它是既含有杀伤性免疫细胞同时还有树突状细胞。树突状细胞因为长得像树杈得名，是免疫系统很重要的一部分。树突细胞并不直接杀死细胞，它只是一种免疫呈递细胞，把信号呈递给杀伤免疫细胞，理论上DC-CIK联合免疫细胞杀死癌症细胞的能力应该更强，但是临床上DC-CIK疗法效果也是很有限，因为它无法突破DC-CIK疗法的瓶颈:癌症的免疫抑制。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的问题是，提供一种通过阻断PD-1肿瘤免疫抑制通路来提高DC-CIK免疫细胞的肿瘤杀伤活性的方法制得的DC-CIK免疫细胞。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法，以外周血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK，CIK细胞每隔2天扩大培养、DC细胞在第4天扩大培养，然后在第7天进行混合培养，DC细胞在第5天用TNF-α进行刺激以促进其分化成熟，然后加入Ant1-PDL-1MAb对DC细胞进行封闭并在封闭12-24h后将全部DC细胞回收加入到CIK细胞诱导体系中共培养;CIK细胞在第7天加入⑶28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在诱导培养的第13-15天使用Ant1-PD-1MAb对CIK细胞的I3D-1抗原进行封闭，并在封闭12-24h后回收全部细胞。
[0005]具体地，包括以下步骤:
[0006]I)采集人体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得I3BMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤从中制备出自体血清；
[0007]2)配置细胞诱导培养基备用
[0008]DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15%的步骤I)中制备的自体血清、80-150 IU/ml 的 IL-4 和800-1500 IU/ml 的 GM-CSF ；
[0009]CIK细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15 %的步骤I)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2;
[0010]3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至T-175细胞培养瓶中，分别加入40-50ml免疫细胞培养基，并加入步骤I)中制备的2-4ml的自体血清，孵育l-2h后将未贴壁的细胞及培养上清吸出，贴壁的细胞中加入40-50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
[0011]4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，将所有细胞加入到提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶;在培养瓶中加入50-100ml CIK细胞诱导培养基，并按照终浓度500-1000IU/ml加入IFN-r，诱导CIK细胞；
[0012]5)培养第3天在CIK细胞诱导体系中按照体积分数5-10 %加入自体血清，并按照终浓度300-1000IU/ml补加IL-2继续培养；
[0013]6)培养第4天在DC细胞诱导体系中加入30-40ml DC细胞诱导培养基，混合均匀后培养；
[0014]7)培养第5天在CIK细胞诱导体系中加入100-150mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0015]8)培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入TNF-a进行刺激，12-48小时之后在DC细胞诱导体系中加入2-20ug的Ant1-PDL-1MAb孵育12-24小时之后回收全部DC细胞加入到CIK细胞诱导体系中，并将全部细胞加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中，加入200-300ml CIK细胞诱导培养基并加入4_10ug的CD3McAb以及15_30ug的CD28McAb；
[0016]9)第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入300-400mlCIK细胞诱导培养基，混合均匀后继续培养；
[0017]10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入600-800ml CIK细胞诱导培养基，
混合均匀后继续培养；
[0018]11)第13-15天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入5-30ugAnt1-ro-lMAb孵育，混合均匀后继续培养；
[0019]12)12_24h后回收全部细胞。
[0020]所述免疫细胞培养基为美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基。
[0021]上述的制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法制得的DC-CIK免疫细胞。
[0022]本发明的有益效果是:本发明通过在体外利用细胞因子高效诱导外周血单个核细胞分化DC-CIK细胞中添加Ant1-PD-lMAb、Ant1-PDL-lMAb后其肿瘤杀伤活性显著提高。本方法采用美天旎公司生产的TexMACS免疫细胞培养基和自体血清、多种细胞因子及联合培养技术对DC、CIK分别进行诱导培养，并且在合适的时间点分别将DC和CIK相关的PD-1位点进行封闭，然后在一定时间点将细胞混合培养并应用，最终混合细胞的肿瘤杀伤活性得到了很大的提尚具有更尚的临床应用价值。
【附图说明】
[0023]图1培养第7天的DC、培养第15天CIK细胞图(左图为诱导培养的CIK细胞，右图为诱导成熟的DC细胞)。
[0024]图2肿瘤细胞杀伤实验图(左图为对照组HELA细胞，右图为杀伤实验组中HELA细胞，右图为效靶比20:1)。
[0025]图3不同效靶比肿瘤细胞杀伤比例图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明:
[0027]本发明的制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法，以外周血为原材料，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC分别诱导DC、CIK，CIK细胞每隔2天扩大培养、DC细胞在第4天扩大培养，然后在第7天进行混合培养，DC细胞在第5天用TNF-α进行刺激以促进其分化成熟，然后加入Ant1-PDL-1MAb对DC细胞进行封闭并在封闭12_24h后将全部DC细胞回收加入到CIK细胞诱导体系中共培养;CIK细胞在第7天加入⑶28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在诱导培养的第13-15天使用Ant1-PD-1MAb对CIK细胞的I3D-1抗原进行封闭，并在封闭12-24h后回收全部细胞。
[0028]具体地，包括以下步骤:
[0029]I)采集人体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得I3BMC和上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤从中制备出自体血清；
[0030]2)配置细胞诱导培养基备用
[0031 ] DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15%的步骤I)中制备的自体血清、80-150 IU/ml 的 IL-4 和800-1500 IU/ml 的 GM-CSF ；
[0032]CIK细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15 %的步骤I)中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2;
[0033]3)分离获得的PBMC取(5-10)*107个细胞接种至T-175细胞培养瓶中，分别加入40-50ml免疫细胞培养基，并加入步骤I)中制备的2-4ml的自体血清，孵育l-2h后将未贴壁的细胞及培养上清吸出，贴壁的细胞中加入40-50ml DC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；
[0034]4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，将所有细胞加入到提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶;在培养瓶中加入5