从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单 体化合物的方法，以及该邻苯二甲酸二丁酯在制备抗肝癌、抗肺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二丁酯是一种通常通过有机合成方法获得的小分子化合物，为无色透 明或略带黄色的油状液体，其分子式为C 16H2204，分子量为278. 35,由一个类似与四兀环的结 构构成其骨架，结构式如下所示：
[0003]
[0004] 现今对于邻苯二甲酸二丁酯的应用主要包括以下几个方面：
[0005] -、用作气相色谱固定液、溶剂；
[0006] 二、用作增塑剂，主要用作硝化纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯等的增塑剂，还可用于制 造油漆、粘接剂、人造革、印刷油墨、安全玻璃、赛璐珞、染料、杀虫剂、香料溶剂、织物润滑剂 等；
[0007] 三、作为纤维素酯、合成及天然橡胶、聚苯乙烯的增塑剂等，用于ICP-AES、AAS、 AFS、ICP-MS、离子色谱等。
[0008] 由于该物质被大众定格为有害的化工产品，且限定于通过合成的方法得到，对于 该分子本身就是天然存在的小分子化合物研究甚少，并且局于以上所述的应用中，因此很 多学者研究了它的毒理作用，如生殖毒性研究、神经毒性研究、急性毒性研究等，而对该小 分子的药效研究比较少。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术问题，以中药三棱为原材料，提 供一种从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法，该方法采用高效液相色谱进行 分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，得到的邻苯二甲酸二丁酯单 体化合物纯度可以达到99%以上。
[0010] 本发明所采用的技术方案为：
[0011] -种从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法，该方法包括以下步骤：
[0012] (1)超低温粉碎：取干燥的三棱为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，同时粉 碎全过程用2~10°C的水作为超微破碎机内部冷却液，超微粉碎时间为5~20min，得到超 微粉；
[0013] (2)溶剂提取：
[0014] (a)乙酸乙酯提取：在超微粉中加入乙酸乙酯，乙酸乙酯的加入体积（L)为超微粉 质量（Kg)的8~10倍，70~75°C加热1~3小时进行提取，离心取沉淀，然后重复1~3 次，最终得到沉淀，为粗品A ;
[0015] (b)乙醇提取：将粗品A干燥后，按料液比（g/mL)为1 : (6~10)加入95%乙 醇，充分混匀后70~75°C加热1~3小时进行提取，离心取沉淀，然后重复1~3次，将得 到的上清合并，于旋转蒸发仪中浓缩后转移至60°C恒温鼓风干燥箱中干燥，得到粗品B ;
[0016] (3)色谱分离：取粗品B用80%甲醇-水溶液（甲醇与水按体积比8 : 2配比而 成，下同理）20~80°C超声溶解至浓度为15~50mg/ml，过膜后通过高压制备液相色谱进 行分离，采用的色谱柱为C18反相硅胶色谱柱，采用A流动相为纯水、B流动相为甲醇的二 元流动相体系，进样量为1~5mL/针，流动相流速为12~20mL/min，洗脱方式为：20%甲 醇-水溶液洗脱5min、40%甲醇-水溶液洗脱7min、80%甲醇-水溶液洗脱13min、100% 甲醇洗脱5min，检测波长为210~280nm，根据紫外吸收光谱收集21-22min洗脱液（11号 峰）作为目的组分，经多功能膜分离系统浓缩后真空冷冻干燥，得到本发明目的化合物邻 苯二甲酸二丁酯。
[0017] 作为优选，所述步骤（1)中超微粉碎时间为12min。
[0018] 作为优选，所述步骤（2)中乙酸乙酯提取和乙醇提取的提取温度为72°C。
[0019] 作为优选，所述步骤（2)中粗品A与95%乙醇的料液比为1 : 8。
[0020] 作为优选，所述步骤（3)中粗品B溶解于80 %甲醇-水溶液的浓度为25mg/ml。
[0021] 作为优选，所述步骤（3)中色谱柱的直径为150mm，柱长为250mm，C18中硅球粒径 为 10 μπι
[0022] 本发明进一步提供上述提取得到的邻苯二甲酸二丁酯单体化合物在制备抗肝癌 药物中的应用。该邻苯二甲酸二丁酯单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射， 与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊 剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓剂、 吸入剂等多种剂型。
[0023] 本发明还进一步提供上述提取得到的邻苯二甲酸二丁酯单体化合物在制备抗肺 癌药物中的应用。该邻苯二甲酸二丁酯单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注 射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶 囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片、注射剂、软膏剂、栓 剂、吸入剂等多种剂型。
[0024] 按照本领域普通技术人员的理解，邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的给药剂量应根 据治疗对象的年龄、体重、疾病严重程度等因素而定，一般可以是〇. 36-1. 27mg/天。
[0025] 由于本发明原料三棱为黑三棱科植物黑三棱的干燥块茎，其化学成分复杂，所以 本发明选用二维高效液相色谱进行有效组分的提取。
[0026] 首先：由于目的化合物邻苯二甲酸二丁酯属于极性较小的小分子物质，所以本发 明先选用极性相对较小的乙酸乙酯作为粗溶剂，根据相似相溶原理，该溶剂可以尽可能多 的溶解掉与目的邻苯二甲酸二丁酯极性相近的一些小分子杂质，该步骤为下面一次色谱分 离就得到99%纯度的邻苯二甲酸二丁酯奠定了坚实的基础；
[0027] 其次，利用邻苯二甲酸二丁酯易溶于乙醇的特点，进行乙醇提取，使得目的物邻苯 二甲酸二丁酯尽可能多地溶解；
[0028] 再次，在色谱分离的条件选择上：多次试验结果显示，C18反相硅胶色谱柱对所提 物质分离效果较好，而通过考察不同流动相组成和不同洗脱方式、流速及进样量后，结果显 示采用本发明" 20 %甲醇-水溶液洗脱5min、40 %甲醇-水溶液洗脱7min、80 %甲醇-水溶 液洗脱13min、100%甲醇洗脱5min"的洗脱方式其分离效果最佳，且进样量在l-5mL/针范 围内、流动相在12-20mL/min范围内时重复性良好，得到馏分中目的化合物邻苯二甲酸二 丁酯纯度高达99%，且目的峰清晰、峰容量相对较大、无拖尾等现象，与其他峰之间分离非 常好，无交叉或重叠等现象，可直接用于后续制药等应用。
[0029] 本发明利用液相色谱制备的方法成功从中药三棱中提取分离得到纯度达到99% 的天然小分子化合物邻苯二甲酸二丁酯，该方法工艺简单，时间周期短，试剂耗费量小，制 备量大，稳定可控，重复性好，实用性高，适用于大规模工业化生产的需要。
[0030] 现在药理研究表明，三棱具有多种药理作用并被广泛应用于心脑血管疾病、妇科 如子宫肌瘤各类疾病的治疗。因此从中分离出具有确切结构并且易于进行化学合成的集抗 癌活性为一体的化合物必将为抗癌新药的研发奠定基础。本发明得到的三棱提取物邻苯二 甲酸二丁酯性质稳定，通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该 化合物对肝癌Η印-g2细胞和肺癌A549细胞具有抑制作用；通过建立小鼠模型，发现该化合 物对肺癌A549细胞系的选择性比较好。实验充分表明，该化合物在体内、体外实验抗肿瘤 作用明显，具有抗癌药物开发潜力，为抗癌天然药物的开发提供了有力的依据。
【附图说明】
[0031] 图1所示的是本发明从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法的高压 液相色谱分离图；
[0032] 图2所示的是本发明从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法得到的 目的组分的HPLC验纯图；
[0033] 图3所示的是本发明从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法得到的 目的组分的C13NMR核磁图；
[0034] 图4所示的是本发明从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法得到的 目的组分的H1NMR核磁图；
[0035] 图5所示的是本发明从三棱中提取邻苯二甲酸二丁酯单体化合物的方法得到的 目的组分的MS质谱图；
[0036] 图6所示的是本发明邻苯二甲酸二丁酯单体化合物对肺癌A549细胞的抑制作 用；
[0037] 图7所示的是本发明邻苯二甲酸二丁酯单体化合物对肝癌Hep_G2细胞的抑制作 用；
[0038] 图8所示的是本发明邻苯二甲酸二丁酯单体化合物抗肺癌实验小鼠平均瘤重；
[0039] 图9所示的是本发明邻苯二甲酸二丁酯单体化合物抗肺癌实验小鼠平均