产蛋下降重要病毒环介导多重pcr快速检测引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及产蛋下降重要病毒环介导多重PCR快速检测引物，属于预防兽医学领 域。
【背景技术】
[0002] 近些年来，我国种禽和蛋禽在饲养过程中因传染病导致的产蛋下降问题愈来愈严 重，主要表现为产蛋量和蛋品质下降，如产蛋量难W达到正常峰值或骤然下降，出现软壳 蛋、沙壳蛋、薄壳蛋、崎形蛋及小型蛋等，严重影响种(蛋)禽的生产性能，造成了巨大经济损 失。现有研究表明，很多病原均可导致种(蛋)禽产蛋下降，如禽坦布苏病毒(ATV)、产蛋下降 综合征病毒(EDSV)、朋亚型禽流感病毒化9AIV)、禽1型副黏病毒(APMV-1)及沙口氏菌等多 种细菌性病原。产蛋家禽的流行病学调查表明，60%W上的产蛋下降病例是由运些病原中的 一种形成单纯感染或几种病原混合感染引起，发病时的临床症状与剖检病变十分类似，有 的还继发或并发其他病原而导致误诊或使病情复杂化延误治疗，从而引发更为严重的经济 损失。
[0003] 禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属的RNA病毒，是2010年4月在我国浙江、江苏 和福建等地新发现的引起开产蛋鸭、种鸭出现W产蛋骤降、低死亡为主要特征的急性高度 接触性传染病的病原。该病毒感染产蛋家禽后主要造成产蛋家禽的卵泡膜充血、出血，卵泡 变性、萎缩及癒痕化等，极大的影响家禽的产蛋性能，发病后2天后家禽产蛋率下降达30%- 70%，严重的于发病后7~14天停产，部分感染病例出现不可逆性停产。到2014年底，我国东南 沿海及周边地区均出现该病的流行，除了产蛋鸭和鸡，碟、肉鸭和麻雀等均有感染报道，该 病已严重危害到我国养禽业的持续健康发展。
[0004] 产蛋下降综合征病毒属于禽腺病毒虹型的DNA病毒，是于1976年发现的引起家禽 W产蛋下降为特征的一种传染病的病原，该病毒感染后主要引起鸡群产蛋骤然下降，软壳 蛋和崎形蛋增加等，故又命名为产蛋下降综合征1976。不同年龄的鸡和鸭均可感染，但幼龄 家禽不表现临床症状。产蛋家禽感染该病毒后，开始发病时有或没有一般性的下频、食欲下 降和萎靡不振，随后蛋壳稱色，接着泛起软壳蛋、薄壳蛋。病程持续4~10周，产蛋下降幅度 达10%~40%，种蛋解化率降低，出壳后弱维增多，产蛋下降持续4~10周后一般可恢复正常。
[0005] 朋亚型禽流感病毒是正黏病毒科的RNA病毒，现有研究表明该病毒感染产蛋家禽 后同样可引起家禽的产蛋率、受精率及解化率下降等危害。当20~30周龄种禽感染时，会 出现的呼吸道症状，同时产蛋量出现群体性下降，4~5天内产蛋量可下降30 %~70 %，部 分病例的产蛋禽甚至完全停止产蛋。4周后，产蛋禽缓慢恢复产蛋，但达不到感染前的水 平。
[0006] 连接酶依赖的PCR扩增技术是一种基于连接酶的核酸PCR检测技术，其工作原理 是:在一段人工合成的外源核酸序列的两端连接与待检病原核酸序列互补的寡核巧酸序列 作为捕获探针，利用该捕获探针与待测样品中的病原核酸杂交，从而在待检核酸链上形成 一个带缺口的、首尾靠近的环，随后在连接酶作用下将该环闭合形成一个完整的环;最后用 针对该环外源核酸序列部分的特异性引物在DM聚合酶催化下进行PCR扩增，达到检测待测 基因的目的。当检测多个目的核酸序列时，只需加入将各自特异性的捕获探针进行杂交，最 后用同一对检测引物进PCR扩增，即可到达鉴别诊断的目的。因在检测过程中设及到探针环 化阶段，故将该技术命名为环介导多重PCR。该技术不直接扩增待检核酸，而是通过扩增与 待检基因特异性杂交的外源基因来达到检测待检核酸的目的，既避免了检测的非特异性， 又因减少了 PCR扩增时的引物数量，使检测效率和敏感性得到了保证。
[0007] 因此，根据连接酶依赖的PCR扩增技术原理，建立一种可快速鉴别诊断禽坦布苏病 毒、产蛋下降综合征病毒、H9亚型禽流感病毒的环介导多重PCR检测方法作为产蛋家禽产蛋 下降病原的常规性检测及疫病突发时病原的及时确诊是十分有效的，为产蛋下降疫病病原 的早期诊断及防治措施的制定和执行提供可靠的技术支撑。
【发明内容】
[0008] 本发明提供产蛋下降重要病毒环介导多重PCR快速检测引物。多重PCR方法是基于 连接酶的工作原理，用特异性的捕获探针与对应的病毒核酸杂交，并在连接酶作用下环化， 随后应用一对通用引物对环化的、针对不同病原的捕获探针进行检测，依据获得的扩增产 物大小确定感染病原。
[0009] 所述连接酶是指DNA化q连接酶。
[0010] 3种引起产蛋禽产蛋下降重要病毒为产蛋下降综合征病毒、禽坦布苏病毒及H9亚 型禽流感病毒，其特异性的捕获探针序列分别如Seq ID No. l，Seq ID No.2和Seq ID No.3 所示。
[0011] 针对3种病毒核酸捕获探针的通用检测引物序列为：上游引物为5'- CTCGGCGCGGGTCTTGTAGTT - 3'，下游引物为5'- CGAGGACGGCAGCGTGCAGCT - 3'。
[0012] 其检测程序主要分3个阶段，第一阶段为变性阶段，95°C维持5 min;第二阶段为连 接酶介导的捕获探针与模板的杂交及探针环化阶段，95°C 50 S，55°C~63°C 5-10 min进 行6个循环;第Ξ阶段为PCR检测阶段95°C 30 s，52°C~56°C 30 s，72°C 30 s进行25个 循环，最后72 °C 10 min结束反应。
[0013] 为获得上述发明目的，本发明采用的技术方案是:依赖于连接酶的环介导多重PCR 扩增方法，包括W下步骤： 1、病原核酸特异性探针的制备:根据GenBank中已发布的产蛋下降综合征病毒的lOOkd 蛋白基因、禽坦布苏病毒的衣壳蛋白基因及H9亚型禽流感病毒的血凝素蛋白基因保守区序 列保守区及增强型绿色巧光蛋白（EGFP)基因的部分序列，设计3对引物，运3对引物的特征 在于5'端分别为W上3种病原核酸序列的互补寡核巧酸序列，3'端为外源基因（本发明中为 增强型绿色巧光蛋白基因）核酸序列。W绿色巧光蛋白质粒作为模板，用运3对引物分别进 行常规PCR扩增，获得的巧巾扩增产物经纯化回收后即可作为病毒核酸特异性捕获探针。
[0014] 2、通用检测引物的设计:根据3种病原捕获探针的共有序列（外源基因部分，即增 强型绿色巧光蛋白基因）设计一对反向引物，该对引物的特征在于其与待检测的病原目的 基因亲缘关系远，特异性的与已环化的捕获探针上的增强型绿色巧光蛋白基因杂交后，在 DNA聚合酶作用下启动PCR扩增过程。
[0015] 3、环介导多重PCR检测方法的建立和优化： (A)环介导多重PCR反应体系的配置，所述环介导多重PCR反应体系总计30 pL，包括 dNTPs 0.3 mM, lOXTaq DNA连接酶反应缓冲液3化，Taq DNA连接酶0.5化，lOXTaq DAN聚合酶反应缓冲液3 pL(含Mgh),化q DM聚合酶0.50 通用检测引物各8 pmol, 巧中捕获探针和DM或cDNA溶液各2 pL，加去离子水补足至30 pL，另外配置一份不含样 品DNA或cDNA的反应液做阴性对照。
[0016] (B)环介导多重PCR的反应程序所有反应均在同一个反应管中完成，主要分3个阶 段，第一阶段为变性阶段，95Γ维持5 min;第二阶段为连接酶介导的捕获探针与模板的杂 交及探针环化阶段，95°C 50 S，55°C~63°C 5-10 min进行6个循环;第Ξ阶段为PCR检测 阶段95°C 30 S, 52°C~56°C 30 S, 72°C 30 S进行25个循环，最后72 °C 10 min结束反 应。扩增结束后立即进行电泳显示检测结果。PCR检测的特异性还可W通过将PCR产物纯化 回收后送生