结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因ugt1a1的snp检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医疗检测领域，更具体的说是设及一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感 性相关基因 UGT1A1的SNP检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 伊立替康（Irinotecan，CPT-11)，也叫开普拓，它对大多数的癌症都具有有效的抗 癌活性，是最普遍的化疗处方药物之一，特别是对提高结直肠癌根治术后的长期生存率具 有重要意义。然而20%的患者采用W伊利替康为基础的联合化疗方案，会发生严重的3-4级 中性粒细胞减少及腹泻，毒性反应是运些患者不能耐受此药治疗的关键原因。伊立替康是 无活性的前药，需经径酸醋酶的活化转变为其活性代谢产物SN-38而发挥效用。具有药物活 性的SN-38的主要清除途径，是通过肝脏UGT1A1的糖基化作用转变为无活性的SN-38G，后者 通过尿液、胆汁排出体内。研究发现UGT1A1的表达是高度可变的，由此引起不同患者间SN- 38糖基化反应的速率相差最高达50倍。UGT1A1基因启动子区具有一定多态性，其不典型 TATA盒区域中包含了5-8个TA重复序列。其中W含6个TA重复序列的基因型最为常见。随着 TA重复序列数目的增加，UGT1A1表达下降。UGT1A1巧8指UGT1A1启动子不典型TATA盒区域包 含了 7个TA重复序列，该变异型与UGT1A1表达下降有关。在伊立替康治疗中，UGT1A1巧8的突 变导致活性代谢产物SN-38的显著积累，从而导致发生腹泻/中性粒细胞减少的几率显著增 加。另外，UGT1A1*6发生突变后，会导致UGT1A1酶活性降低，也会导致SN-38在体内的积累。 因此，UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与伊立替康相关的严重毒副作用的发生。美国 食品和药品监督管理局要求伊立替康的包装上注明该药容易使UGT1A1巧8纯合突变患者产 生嗜中性白血球减少症，并且叮嘱临床医师慎重考虑给药剂量。
[0003] 目前针对基因多态性的检测方法最常见方法为测序法，该方法适合高通量多位点 的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测;高分辨率溶解曲线法对设备要求 比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、溫度比较敏感的机器才能使用，它的临床推广存在 一定的困难。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够实现快速检测结肠癌 化疗药物伊立替康敏感性相关基因 UGT1A1的SNP检测试剂盒及其使用方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0006] -种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因 UGT1A1的SNP检测试剂盒，其特征 在于:包括下列体积份的组成构成： 引物 1~2份 探针 心2份
[0007] 预混液 10~25份 溶剂 10~15份
[000引所述引物为UGT1A1巧8引物和UGT1A1*6引物，
[0009] 所述UGT1A1巧8包括：
[0010] 正向引物:1161'141巧8斗：5'-44〔47^4(：1766了6了41^6-3'； [00川反向引物:1]61'141巧8-1?:5'-了〇：了6〇：464661'1^6-3'；
[001^ 所述UGT1A1*6引物包括：
[0013] 正向引物:1]61'141*6斗：5'-〔40：了64〔60：1^6176了4-3'；
[0014] 反向引物：1]61'141*6-尺：5'-〔4666了4〔61'(：1'1^4466了6了444-3'；
[0015] 所述探针为UGT1A1巧8探针和UGT1A1*6探针
[0016] UGT1A1巧8探针包括：
[0017] UGT1A1巧8野生型探针：
[001 引 5 ' -巧光基团-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3 ' ；
[0019] UGT1A1巧8突变型探针：
[0020] 5 ' -巧光基团-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3 ' ；
[0021] 所述UGT1A1*6探针包括：
[0022] UGT1A1*6野生型探针:5'-巧光基团-CATCAGAGACGGAGCAT-MGB-3' ；
[0023] UGT1A1*6突变型探针:5'-巧光基团-ATCAGAGACAGAGCAT-MGB-3'。
[0024] 作为本发明的进一步改进，所述预混物为2 X PCR酶反应预混液，所述2 X PCR酶反 应预混液含有0 . lunits/μL 的Taq DNA Polymerase (recombinant)、4mmol/L的MgCl2、 0.5mmol/L的dNTPs。
[0025] 作为本发明的进一步改进，所述溶剂为双蒸水。
[0026] 作为本发明的进一步改进，所述引物和探针体积比为1:1。
[0027] 作为本发明的进一步改进，所述正向引物和反向引物用量相同。
[0028] 作为本发明的进一步改进，所述UGT1A1巧8野生型探针和UGT1A1巧8突变型探针用 量相同。
[0029] 作为本发明的进一步改进，所述UGT1A1*6野生型探针和UGT1A1*6突变型探针用量 相同。
[0030] 试剂盒的使用方法，包括W下步骤：
[0031] 1)提取待测人的基因组DNA;
[0032] 2)每个PCR体系为包含体积分的:预混液10~25份，DNA模板1份，引物1~2份、探针 1~2份；
[0033] 3)将配置好的PCR体系放入巧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测;反应条件 为：
[0034] 95°C 10分钟预变性;循环阶段，95°C 15秒并在此采集巧光信号，60°C 1分钟，40-60 个循环；
[0035] 4)通过巧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
[0036] 作为本发明的最优选方案，
[0037] 1)提取待测人的基因组DNA;
[0038] 2)每个PCR体系中，包含2 X PCR酶反应预混液15化，DNA模板化L，正向反向引物各1 化，野生型和突变型巧光探针各化L，双蒸水10化；
[0039] 其中2 XPCR酶反应预混液成分及含量：Taq DNA Polymerase(recombinant): 0.1 un i t S /μ 1; MgC 12: 4mmo 1 /1; dNTPs (dATP，dCTP，dGTP，dTTP): 0.5mmo 1 /1;
[0040] 其中基因组DNA模板中DNA含量lO-lOOng，正向反向引物浓度100-100化M，野生型 和突变型巧光探针浓度lOO-lOOOnM;
[0041 ] 3)将配置好的PCR体系放入巧光定量PCR仪中，进行Real-time PCR检测;反应条件 为：
[0042] 95°C 10分钟预变性;循环阶段，95°C 15秒并在此采集巧光信号，60°C 1分钟，40-60 个循环；
[0043] 4)通过巧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
[0044] W人基因组DNA为模板，分别加入检测UGT1A1*28型、UGT1A1*6型多态性的对应特 异引物和巧光探针，构成实时巧光定量PCR体系，经过Real-time PCR反应，通过巧光定量 PCR仪所收集的数据确定UGT1A1的基因型。
[0045] 本发明的有益效果，本发明与现有技术中的直接测序法相比，不需要复杂的设备， 本身就是对人体基因组中的一个序列进行检测。用巧光PCR法直接对提取出来的人DNA进行 检测，具有较高的分辨度，不需要测序仪器，就可W是实现对于结肠癌化疗药物伊立替康敏 感性相关基因的检测。同时，也大大缩短了检测时间，在判断上也十分直观，从最终导出的 数据图中就可W直接得出结论，在判断上更加容易。
[0046] 本申请方案具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。
【附图说明】
[0047] 图1为UGT1A1巧8位点野生型样品巧光定量PCR曲线图。
[004引图2为UGT1A1巧8位点杂合突变型样品巧光定量PCR曲线图。
[0049]图3为UGT1A1巧8位点纯合突变型样品巧光定量PCR曲线图。
[(K)加]图4为UGT1A1*6位点野生型样品巧光定量PCR曲线图。
[0051 ]图5为UGT1A1*6位点杂合突变型样品巧光定量PCR曲线图。
[0052] 图6为UGT1A1*6位点纯合突变型样品巧光定量PCR曲线图。
【具体实施方式】
[0053] 下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
[0054] 参照图1所示，本实施例的一种结肠癌化疗药物伊立替康敏感性相关基因 UGT1A1 的SNP检测试剂盒，其特征在于:包括下列体积份的组成构成： 引物 1~2份 探针 1~2粉
[0化5] 预混液 10~25份 溶剂 10~15份
[0056] 所述引物为UGT1A1巧8引物和UGT1A1*6引物，