。
[0060] SFTPB、FGFR1和FILIP1L基因整合后诊断阔值的计算：SFTPB、FGFR1和FILIP1L基因 表达Ct值采用内参基因进行归一化处理，W祀基因与内参基因的比值进行阔值计算。归一 化后的祀基因相对表达量带入方程y = l.77x1+3.68x2-x3进行计算，其中y表示联合预测因 子，xl表示样本FGFR1基因用内参基因归一化后的相对表达量，x2表示样本SFTPB基因用内 参基因归一化后的相对表达量，x3表示样本FILIP1L基因用内参基因归一化后的相对表达 量。将临床样本测得祀基因表达量归一化后带入方程进行计算，若y大于34.44为阳性，即该 样本诊断为肺癌患者;若y小于34.44为阴性，即该样本诊断为正常。
[0061 ] (3)试剂盒检测体系的批内和批间重复性
[0062] 随机取任一样本，在一次实验中重复6次同时检测，考察批内重复性;随机取任一 样本，在不同时间重复6次反应，考察批间重复性，结果见表2。
[0063] 表2批内和批间基因重复性
[0064]
[0065] 由表2可知，该试剂盒检测方法体系的批内基因绝对量的RSD为0.69%，批间基因 绝对量的RSD为1.09%，均小于5%。W上数据充分说明所建立的检测方法体系具有很好的 批内和批件重复性，可W保证测定结果的准确可靠。
[0066] 实施例2临床样本检测
[0067] 1、临床样本收集：
[006引本研究共收集到50例健康志愿者样本，50例肺癌患者样本。
[0069] 2、新鲜外周血中总RNA的提取：
[0070] (1化DTA(乙二胺四乙酸)抗凝的全血lmL，5000巧m离屯、lOmin，弃血浆，加入红细胞 裂解液ImL，充分混匀，置冰上反应15min，5000巧m离屯、5min;
[0071] (2)弃上清液，加入PBS(F*hos地ate Buffered Saline,憐酸盐缓冲液）lmL，充分混 匀，500化pm离屯、5min;重复操作Ξ次，至上清液透明，弃上清液；
[0072] (3)下层沉淀细胞中加入ImL Trizol试剂，充分混匀，室溫放置5min;
[0073] (4)加入氯仿200yL，充分混匀30s，室溫放置3min，10000巧m离屯、20min;
[0074] (5)取上清液50化L，至新的阳管中，加入异丙醇50化L，混匀后-80°C放置过夜;或 室溫放置半小时，直接进行第(6)步离屯、操作。
[00巧](6)从-8(TC取出阳管，室溫溶化后，10000巧m离屯、30min，弃上清液，加入1血、75% 乙醇一DEPC水(V/V，DEPC为焦碳酸二乙醋）溶解，充分混匀，7500巧m离屯、1 Omin;
[0076] (7)弃上清液，沉淀室溫风干，加入22化的DEPC水溶解，得总RNA溶液，待用，或-80 °C保存。
[0077] 3、cDNA 的合成：
[007引（1)取化L总RNA溶液，50倍稀释，经紫外分光光度仪测定0D(吸光度），计算上述提 取所得总RNA的浓度，并检测0D260/280含1.如角定纯度；
[0079] (2)取0.化g总RNA和逆转录试剂，按表3的cDNA合成反应体系，加样进行反应;所述 试剂采用美国^Thermo Scientific公司的Reve;rtAid First Strand cDNA Synthesis Kit, 也可用其他公司同类型产品。
[0080] 表3:cDNA合成的反应体系
[0081]
[0082] (3)将反应体系置于37 °C解化60min，cDNA产物-20°C保存。
[0083] 4、样本定量检测
[0084] W样本cDNA作为模板，采用化qman巧光定量PCR反应法，在ABI Prism7300实时巧 光PCR扩增仪中进行反应，反应体系及反应条件见表1dPCR的扩增条件为：95°C预变性 1〇111111，95°(：变性1〇3,60°(：退火3〇3,72°(：扩增3〇3，进行45个循环。
[0085] 采用法对样本中祀基因的相对含量进行计算。计算结果如表4所示。
[00化]表45。了?8古6。31^比1?化1111?酷的相对含量
[0087]
[0089] 注值是指归一化后祀基因相对含量与正常组的比值。
[0090] 图1是W祀基因在样本中测定Ct值变化的Act进行做图，Act与样本中祀基因的 含量成反比，Act增大，说明祀基因在样本中的含量降低。由此可知，在肺癌患者样本中 SFTPB和FILIP1L mRNA的表达量增加，FGFR1 mRNA的表达量降低。
[0091] 综上所述，5。了?8^6。31^化1?化基因在外周血单核细胞中的表达可^作为肺癌 诊断的潜在生物标志物。
[0092] 对于上述Ξ个基因的对肺癌患者的诊断能力及疗效评价能力，本研究采用受试者 工作特征（Receiver operatin characte;ristic，ROC)曲线进行了评价。R0C曲线是用W评 价标志物准确度的一种重要工具。可W得到的两个主要指标包括:灵敏度(sensitivity), 或真阳性率，评价其在选择特定疾病病人中的表现。在筛选测试中一般要求有高灵敏度W 排除没有疾病的人;特异性(specificity),或真阴性率，指示其在正确选择没有疾病的人 中的能力。在诊断中一般要求有高特异性W获得较低的假阳性率。首先对Ξ个祀基因进行 R0C曲线分析，结果如图2所示。其中，横坐标为100-特异性，即假阳性率，纵坐标为灵敏度， 即真阳性率。
[0093] 由图2可知，Ξ个祀基因在区分正常对照(50例)和肺癌患者(50例)时，诊断准确率 均能达到90%W上，FGFR1和FILIP1L基因具有更高的灵敏度，SFTPB基因则具有更高的诊断 特异性。深入研究发现，将试剂盒中的Ξ个祀基因进行整合，相较于单个基因，其诊断能力 可得到提高。首先建立logistic回归模型，得到联合预测因子，预测因子的表达式为：y = 1.77x1+3.68x2-x3，其中y表示联合预测因子，xl表示样本FGFR1基因的表达量，x2表示样本 SFTPB基因的表达量，x3表示样本FILIP1L基因的表达量。将每个样本Ξ个祀基因的表达量 测定结果带入预测因子方程，得到各个样本的预测因子，并W其为分析指标，进行双正态模 型R0C曲线分析，结果如3所示。
[0094] 由图3可知，Ξ个祀基因进行整合后，其诊断灵敏度和特异性均得到改善，整合后 得的预测因子进行肺癌诊断的灵敏度和特异性分别达到100%和90%、91%，且R0C曲线下 面积为0.983(P<0.0001)，说明Ξ个祀基因整合后用于肺癌诊断具有98.3%的诊断准确率， 具有临床诊断应用价值，可作为临床肺癌诊断的辅助分子指标。
[0095] 样本中测定5。了口8^6。31^化1口化基因归一化后的相对表达量带入方程7 = 1.77xl+3.68x2-x3进行计算的道联合预测因子(y值Ky>34.44,该样本判定为疾病样本;y < 34.44，该样本判定为正常样本。
[0096] 此外，该整合基因标志物组也可考虑作为未来药物研发的治疗祀点和评价指标， 进行药物筛选和新药研发。
[0097] W上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围W权利要求书为准。
【主权项】
1. 用于检测肺癌的基因标志物，其特征在于，包括SFITB基因、FGFR1基因和FILIP1L基 因。2. 用于检测肺癌的引物和探针，其特征在于，包括SFTPB引物探针组、FGFR1引物探针组 和FILIP1L引物探针组，核苷酸序列如下： SFTPB引物探针组： 上游引物：SEQ ID N0:1， 下游引物：SEQ ID N0:2， 探针：SEQ ID N0:3; FGFR1引物探针组： 上游引物：SEQ ID N0:4， 下游引物：SEQ ID N0:5， 探针：SEQ ID N0:6; FILIP1L引物探针组： 上游引物：SEQ ID N0:7， 下游引物：SEQ ID N0:8， 探针：SEQ ID N0:9; 其中，探针的核苷酸序列5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。3. 根据权利要求2所述的用于检测肺癌的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团 为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。4. 一种肺癌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的用于检测肺癌的引物 和探针。5. 根据权利要求4所述的肺癌检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因 GAPDH的检测 引物和探针，其具体核苷酸序列为上游引物:SEQ ID NO: 10,下游引物SEQ ID NO: 11，探针： SEQ ID NO: 12;探针的核甘酸序列5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。6. 根据权利要求5所述的肺癌检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品，阳性对照 品包括梯度浓度的SFTPB基因、FGFR1基因、FILIP1L基因以及GAPDH基因。7. 根据权利要求5所述的肺癌检测试剂盒，其特征在于，还包括TaqMail? Universal PCR Master Mix和RNase-free water。8. 权利要求4~7任一所述的肺癌检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取样本总RNA，逆转录合成cDNA; (2) 以cDNA为模板，分别使用权利要求2所述的用于检测肺癌的引物和探针进行荧光定 量PCR反应，收集荧光信号，获取FGFR1基因、SFIPB基因和FILIP1L基因的表达量；当试剂盒 中含有内参基因时，使用内参基因 GATOH的检测引物和探针进行荧光定量PCR反应，GAPDH基 因 PCR反应结果用于对三个目的基因的测定结果进行归一化，校正由起始取样量导致的Ct 值差异； (3) 计算联合预测因子:联合预测因子的表达式为:y=l .7711+3.68乂2-13，其中7表示 联合预测因子，xl表示样本FGFR1基因用内参基因归一化后的相对表达量，x2表示样本 SFTPB基因用内参基因归一化后的相对表达量，x3表示样本FILIP1L基因用内参基因归一化 后的相对表达量；当y>34.44,该样本判定为肺癌阳性；当y<34.44,该样本判定为肺癌阴 性，即正常样本。
【专利摘要】本发明公开了用于检测肺癌的基因标志物，其包括SFTPB基因、FGFR1基因和FILIP1L基因。通过研究发现肺癌患者血液单核细胞中SFTPB、FGFR1和FILIP1L？mRNA表达异常，其整合后对肺癌的诊断准确率达到98.3％，其诊断的特异性和灵敏度也远远优于单个基因。通过对三个基因SFTPB、FGFR1和FILIP1L血液中表达量的测定，达到肺癌的诊断(特别是早期肺癌，即肺癌已经发生，但人体基本没有症状)，辅助提高临床肺癌的检出率，降低肺癌患者的死亡率。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671181
【申请号】CN201610168981
【发明人】王义明, 罗国安
【申请人】王义明
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月23日