基于代谢物及基因表达筛选三七皂苷合成关键基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及Ξ屯中Ξ祗皂巧合成途径关键基因的筛选，具体的是结合一年生Ξ屯 代谢物含量及Ξ祗皂巧合成途径关键基因的表达量进行典型关联分析（canonical correlation analysis)，筛选出^屯中对皂巧含量贡献度较大的Ξ祗皂巧合成途径关键 基因。
【背景技术】
[0002] Ξ^;：；(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.化en)为五加科人参属植物，是我国传统珍 贵药材，其主要生理活性成分为Ξ屯皂巧。Ξ屯的应用在古代主要作为金创要药，用于体内 外各种出血及跌打损伤、疲滞肿痛的治疗。现代药理学研究表明Ξ屯总皂巧和部分单体皂 巧在血液及屯、血管系统、系统代谢、免疫及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好的生理活性，其多 方面的药理作用及保健功能越来越受到人们的重视。目前Ξ屯皂巧的主要来源是从栽培Ξ 屯提取得到的，然而Ξ屯为多年生草本植物，生长周期长，且生长条件苛刻、地理分布窄，加 之病虫害严重、连作障碍、农药残留等问题，其产量已难W满足快速增长的市场需求。
[0003] 近年来，针对药用植物次生代谢产物的基因调控已成为分子生物学研究的热点， 而皂巧类物质是植物次生代谢产物的重要组成部分，其含量和组成主要取决于生物合成关 键基因在细胞中的表达水平。在植物细胞中，祗类化合物主要来源于两个前体物质，异戊締 基焦憐酸（IPP)及其异构体二甲基締丙基焦憐酸(DMAPP)。细胞质中的甲径戊酸(MVA)途径 和质体中的2-C-甲基-D-赤薛糖醇-4-憐酸(MEP)途径都能够产生IPP和DMAPP，且两条途径 所产生的IPP可W穿过质体膜互为对方所用。IPP分子和两个DMAPP分子在法尼基焦憐酸合 酶(FPS)的作用下生成法尼基焦憐酸(FPP)，两个FPP分子在整締合酶(SQS)的作用下W头- 头方式还原偶联生成Ξ祗类物质的前体整締。随后，整締在整締环氧酶(SE)的作用下氧化 成2,3-氧化整締，达玛烧二醇合成酶(DS)催化2,3-氧化整締环化为达玛締二醇。达玛締二 醇是达玛烧型四环Ξ祗皂巧类的骨架，在细胞色素 P450单加氧酶及多种糖基转移酶的作用 下最终形成不同类型的达玛烧型四环Ξ祗皂巧。目前，植物Ξ祗皂巧合成途径中的一些关 键酶基因已在人参属植物中克隆和鉴定，研究证实它们的表达对Ξ祗皂巧合成起着重要调 控作用。此外，Niu等人对FPS，SS，沈和DS等基因在四年生Ξ屯开花期的表达进行了分析，为 进一步阐明皂巧类物质在Ξ屯中的合成机制打下了基础。
[0004] 本发明W探索Ξ屯中Ξ祗皂巧合成关键酶基因表达水平和代谢物含量的关联性 为出发点，应用高效液相色谱-质谱联用系统对一年生Ξ屯不同部位的代谢物含量进行了 分析，同时利用巧光定量PCR技术对其皂巧合成途径关键酶基因表达量进行定量分析，并且 通过典型关联分析构建了Ξ屯基因-代谢物相关图，对关键基因进行了筛选。在本发明之 前，尚未出现设及基于Ξ祗皂巧含量及其合成途径关键基因表达量对Ξ屯Ξ祗皂巧合成关 键基因进行筛选的公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于构建Ξ屯生长发育早期皂巧合成关键基因和代谢物含量的关 系网络，筛选Ξ屯植物中对皂巧合成有重要作用的关键基因。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案包括下列步骤：
[0007] 1)分析一年生Ξ屯不同部位皂巧类物质代谢轮廓。
[0008] 2)测定皂巧合成途径关键基因在Ξ屯不同部位的表达。
[0009] 3)构建基因-代谢物关系网络，筛选Ξ屯中皂巧合成关键基因。
[0010] 上述方法中，所述Ξ屯不同部位为一年生Ξ屯的叶、叶柄及根部。
[0011] 步骤1)所述分析皂巧类物质代谢轮廓是采用高效液相色谱-质谱联用系统对不同 部位样品甲醇提取物进行检测，使用内标法通过标准曲线进行定量。分析方法参照Li等人 "Global analysis of chemical constituents in Shengmai injection using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry"论文 中报道的皂巧定量方法。
[0012] 步骤2)所述Ξ屯不同部位皂巧合成途径关键基因的表达是采用巧光定量PCR(RT- Q-PCR)技术进行检测的。具体是分别提取样品RNA，再将RNA反转录合成第一链cDNA，WcDNA 为模板，按照Takara公司SYBR Premix ExTaq?说明书中针对LightCycler?96实时巧光定 量PCR仪推荐的方法进行设置。
[0013] 上述巧光定量PCR反应中的特异性引物具体序列参见表1。
[0014] 表1 RT-Q-PCR中使用的基因引物序列
[0015]
[0016] 所述实时巧光定量PCR检测的反应条件为:95°C预变性2min，95°C变性10s，57°C退 火15s，72°C延伸30s，45个循环。
[0017] 步骤3)中所述基因-代谢物关系网络的构建和生物合成关键基因的筛选是通过典 型关联分析将Ξ屯皂巧含量与皂巧合成途径关键基因表达量相结合分析得到的。具体的是 使用皮尔逊相关系数对皂巧含量及皂巧合成途径关键基因的表达量进行典型相关分析，变 量相关系数高于0.5作为筛选关键合成基因的标准。
[0018]本发明基于一年生Ξ屯中皂巧类物质代谢及皂巧合成途径关键基因的表达构建 了基因-代谢物关系网络，对Ξ屯生长初期皂巧合成关键基因进行了筛选，为进一步阐明Ξ 屯中皂巧类物质合成机制提供了重要信息，同时为通过基因调控等手段提高Ξ屯皂巧含量 提供了重要依据。
【附图说明】
[0019 ]图1为Ξ祗皂巧类物质在生物体内合成途径；
[0020]图2为一年生Ξ屯不同部位皂巧类物质代谢轮廓谱图，其中A是标准品混合溶液，Β 是一年生Ξ屯叶，C是一年生Ξ屯根，D是一年生Ξ屯叶柄；
[0021 ]图3为皂巧在不同部位分布及含量热图；
[0022] 图4为一年生Ξ屯不同部位皂巧含量PCA分析图，其中1是一年生Ξ屯根，2是一年 生Ξ屯叶柄，3是一年生Ξ屯叶；
[0023] 图5为皂巧合成途径关键基因在一年生Ξ屯不同部位中的表达；
[0024] 图6为一年生Ξ屯基因-代谢物关系网络。
【具体实施方式】
[0025] 下面对本发明的实施例作详细说明，W下实施例将有助于本领域的技术人员进一 步理解本发明，但不W任何形式限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均 为常规方法。下述实施例中所用的试剂如无特殊说明，均为市售购买产品。
[00%]实施例1:代谢轮廓分析。
[0027] 1)材料与方法
[00%]所用植物材料来自于本实验室栽培Ξ屯，Ξ屯种子购于云南省文山州，于2013年 12月播种于溫室，严格按照Ξ屯种植标准，保证Ξ屯生长环境的阴凉避光及适宜的溫湿度。 于来年6月对一年生Ξ屯植株的叶、叶柄及根部分别取材，样品经液氮速冻后，冷冻保存于- 80°C冰箱。
[0029] 2)样品提取
[0030] 将各样品研磨成粉末，经48小时的冷冻干燥后用甲醇对样品进行提取。准确称量 50mg样品溶于1.5mL甲醇，满旋Imin，室溫超声提取半小时，所得混合溶液过夜静置， 12000rmp离屯、取上清液。剩余物用甲醇再次提取，超声处理1小时，离屯、，将两次离屯、的上清 液混合用于皂巧含量的测定。根及叶柄提取物稀释2倍，叶提取物稀释5倍，所有样品进样前 经0.22WI1有机滤膜过滤。
[0031] 3)皂巧代谢轮廓分析
[0032] 参考Li等人在"Global analysis of chemical constituents in Shengmai injection using high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrome化y"论文中报道的皂巧定量方法，采用高效液相色谱-质谱联用技术对上 述样品提取物进行分析得到不同部位代谢轮廓谱。