一种高产橙皮苷酶的黑曲霉kh005及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物领域，具体设及一种高产澄皮巧酶的黑曲霉K册05及其应用。
【背景技术】
[0002] 澄皮巧酶是水解澄皮巧关键酶，具有很高的应用价值。利用澄皮巧酶水解澄皮巧 可W得到澄皮素单糖巧、澄皮素、鼠李糖和葡萄糖。此外将澄皮巧酶添加到枯瓣罐头中，水 解其中的澄皮巧，可W防止相枯罐头产生白色沉淀。
[0003] 澄皮巧酶可由多种微生物产生，如青霉菌、米曲霉、黑曲霉和拟杆菌属等。目前国 内关于产澄皮巧酶菌株的研究还比较少，已有报道的产澄皮巧酶的菌株多为霉菌。
[0004] 目前，在国内澄皮巧酶的研究基本都停留在实验室阶段，还不能够进行工业生产； 商品酶制剂主要依赖进口，价格也比较昂贵（1200元/kgW上）。采用现有的菌株生产澄皮巧 酶成本比较高，很难达到工业化生产的要求。已有报道的菌株产酶效率均不高，培养时间一 般都在5-7天;且酶的热稳定性较差，当在大于45°C的水浴中处理30min左右，酶活便出现了 明显的下降。因此，筛选出产酶效率高，且酶热稳定好的菌株是澄皮巧酶能够工业化应用关 键。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种高产澄皮巧酶的黑曲霉KH005,解决现有菌株生产澄皮 巧酶的效率低、生产的澄皮巧酶的热稳定性差的问题，降低澄皮巧酶的生产成本，W实现工 业化生产。
[0006] 此外，本发明还提供黑曲霉K册05的应用。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现：
[000引一种高产澄皮巧酶的黑曲霉K册05,所述黑曲霉K册05保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、，保藏名称为K册05,其保藏号为:CGMCC12101。
[0009] 本发明中设及保藏的黑曲霉K册05的保藏信息如下:保藏单位：中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中屯、;地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物 研究所;保藏日期：2016年1月25日；保藏编号：CGMCC12101，保藏名称为K朋05 ;分类命名： Aspergillus niger。
[0010] Κ册05菌株的鉴定：
[0011] 1)、DNA 提取：
[0012] 收集菌体，溶于5血提取缓冲液（lOOmMTris · CiaOOmM化逊)TA，200mM化Cl，2% CTAB，p 服.0)中，37°C振荡 45min。加入 0.75mL 20%SDS，65°C水浴化。12,000rpm，离屯、 lOmin，收集上清。上清用等体积的酪:氯仿:异戊醇（25:24:1)抽提2次，加入终浓度0.3M的 NaAC(抑5.2)及2倍体积的无水乙醇，室溫沉淀化。4 °C，12，00化pm，离屯、20min，收集沉淀，用 70%乙醇漂洗2次，惊干后溶于50μΙ TE( lOmmTris-Hcl，ImmNas抓TA)中，即得总DNA。
[001引 2)、扩增ITS序列：
[0014] w上述总DNA为模板，真菌通用引物口S1(SEQ IDNo.2:TCCGTAGGTGAACC TGCGG)和 ITS4(SEQ ID No. 3:TCCTCCGCTTATTGATATGC)分别为正向引物和反向引物扩增ITS序列。扩 增反应体系为50化：10 X Buf f er扣L，dNTP 1化，Taq酶0.扣L( 2U)，正反向引物各化L，模板 DNA lyL，ddH20 40.扣L。扩增反应条件：94°C4min 预变性；94°C0.5min，55°Clmin，72°C 0.5min，30 个循环；72°C 延伸 7min。
[001引 3)、ITS序列分析：
[0016]将扩增的ITS片段送上海生工测序，扩增片段测序结果SEQ ID No. 1所示;通过美 国国家生物技术信息中屯、的BLAST捜索程序进行比较获得同源性分析结果如表1所示： [0017]表1扩增片段的同源性比对分析 [001 引
[0019] 进一步地，黑曲霉KH005是W积实为原料，在培养基中经过初筛选挑选出产澄皮巧 酶能力强的菌株，将初筛选出的菌株在培养基中经过多次转接筛选获得。
[0020] 所述积实原料通过市场购买获得。
[0021] 进一步地，培养基的成分为:2.0g硝酸钢、0.05g氯化钟、l.Og憐酸二氨钟、18.0g澄 皮巧、20. g琼脂和1L蒸馈水。
[0022] 进一步地，培养基的初始pH值为6.0-6.5。
[0023] 黑曲霉K册05的筛选过程：
[0024] 1)、培养基的制备:将2. Og硝酸钢、0.05g氯化钟、l.Og憐酸二氨钟、18.Og澄皮巧、 20. g琼脂溶解与1L蒸馈水中，并用1M的盐酸调抑为6.0-6.5，分装Ξ角瓶，121°C灭菌15min， 待培养基冷至50-55 °C时，倒平板，冷却后备用。
[0025] 2)、菌株的初筛:无菌条件下取20克积实于装有200mL无菌水Ξ角瓶中，置揺床上 室溫振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到ΙΟΛ取各稀释度菌液ImL放入无菌平皿中，倒 入灭菌后冷却至50°C的培养基，混匀，待凝固后放入30°C培养箱培养5天，观察菌落周围透 明圈的大小进行初筛，挑取有透明圈的菌株保经进一步纯化后保存到斜面培养基;然后将 纯化后的菌株接种到平板培养基上培养5天，测量透明圈的直径，结果如表2所示。因为澄皮 巧酶分解澄皮巧产生在菌落周围形成透明圈，所W通过透明圈的大小可W初步判断菌株产 澄皮巧酶能力的大小。挑选菌落周围有透明圈的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察 发现均为霉菌。
[0026] 表2初筛得到菌株的菌落形态及透明圈直径
[0027]
[002引 3)、菌株的复筛：
[0029] 将初筛的菌株经过多次转接后发现，大部数菌株菌落生长逐渐变得缓慢，形成的 透明圈也越来越小。经过多代筛选，最终获得了一株生长迅速、色素少且产澄皮巧酶能力稳 定的菌株K册05,根据形态初步鉴定为霉菌。
[0030] 进一步地，黑曲霉K朋05的菌落特征如下：所述黑曲霉的菌落在PDA培养基上福射 生长，30°C培养3天直径为30-40mm;初为白色，后变成黑色厚绒状，周围有白色的晕圈，菌落 背面呈浅褐（菌落形态图如图1所示）；其分生抱子头呈球形，小分生抱子头呈疏松柱形排 列；分生抱子梗直接生于基质或生于气生菌丝，分生抱子梗为球形或近球形，呈褐色，抱子 表面平滑。
[0031] 将4°C保存的菌株用PDA斜面培养基活化3天，然后用接种针挑取斜面的菌落接种 到PDA平板培养基上，于30°C培养3天，观察菌落形态，于显微镜下观察分生抱子及分身抱子 梗的形态（如图2所示）。用扫描电镜Quanta?450FEG观察菌体的超微结构（如图3和图4)所 /J、- 〇
[0032] 一种高产澄皮巧酶的黑曲霉K册05的应用，黑曲霉K册05用于生产澄皮巧酶。
[0033] 将KH005菌株接种到发酵培养基中，发酵培养基的组分如表3所示，在30~35°C条 件下，150~2(K)rpm，发酵培养6~8天;然后过滤，去掉菌体残渣，收集得到粗酶液，4°C冷藏 保存备用。
[0034] 表3发酵培养基组分
[0035]
[0036] ~试验证明，本发明所述KH005菌株与现有菌株相比生产澄皮巧酶的效率高(例如已' 经公告的申请号为200610051963. X的发明专利，其采用液态培养时，澄皮巧酶的酶活为 14000U/g，采用固态培养时，澄皮巧酶的酶活为6000U/g;且原料的投入量较大，不利于工业 化生产），且生产的澄皮巧酶的热稳定性好，原料的投入量少，更容易实现工业化生产，产澄 皮巧酶的效率通过测定上述粗酶液中澄皮巧酶活性得知，具体测定过程如下：
[0037] 试管中加入5ml pH4.5的醋酸-醋酸钢缓冲液、4.5ml浓度为0.2%的澄皮巧底物溶 液，在45 °C水浴下保溫5min，然后加入0.5ml上述粗酶液，充分摇匀，准确计时，45 °C反应 20min，再迅速移入沸水浴中灭活lOmin，采用高效液相色谱法测得剩余底物量，得出底物减 少量，从而测出酶活。
[0038] 计算公式如下：
[0039] 粗酶液的酶活力化/ml) = (b-a)/(20X0.5);其中，a(μg)为酶解后剩余底物含量； b(yg)为反应前的底物含量。
[0040] 测定结果表明该粗酶液澄皮巧酶活性为2218U-2548U。
[0041 ]对于酶活的计算方式主要包括两种:一种是按照液体体积计算U/ml;另一种是按 照所投原料的质量计算U/g，本发明所述的酶活经过优化后3-4天酶活(按照液体体积计算 U/ml)便可W达到2000UW上，如果按照所投原料的质量计算，我们的菌株酶活可W达到 80000U/gW 上。
[0042] 本发明采用的培养基与已公告专利200610051963.X的培养基不同，投入原料的质 量比较少，经过换算实际我们投入原料的质量不到已公告专利所投料的1/7。我们在实际的 生产中发现，投料太多，液态发酵的时候培养基会很粘稠，容易导致灭菌不彻底，且产生大 量的气泡影响通气，反而不利于微生物的发酵产酶。我们的菌株在投料量比较少的情况下， 可W获得比较好的产酶效果，更容易实现工业生产。
[0043] 澄皮巧酶的酶活定义:在45°C、pH4.5的条件下，每分钟转化1微克澄皮巧底物所需 的酶量为一个酶活力单位化)。
[0044] 酶活的定义不同文章或者专利有一定的差异，但是我们酶活的定义采用的是目前 比较公认的一种定义。可W参见文献（申丽静，汪創.澄皮巧酶的制备及其催化性质的研究 [D].浙江工业大学，2006 : 63 ;孟娜，魏胜华，郑长龙.黑曲霉发酵产澄皮巧酶的工艺优化 [J].生物技术，2011,21(2): 77-80)。
[0045] 并且，对制备的粗酶液中的澄皮巧酶的热稳定性进行测定：
[0046] 通过将澄皮巧酶置于一定溫度下进行培养，每隔一段时间测量澄皮巧酶的酶活， W最初的澄皮巧酶的酶活进行比较来判断澄皮巧酶的热稳定性，申请人通过实验证明：通 过本发明所述的黑曲霉K册05生产的澄皮巧酶的热稳定性好:在50-55°C条件下反应7化后， 酶活可W保存50 %左右;在60-65 °C条件下反应24h酶活依然可W保存50 %左右，即在50-55 °C条件下，酶的半衰期为72h，在60-65°C条件下半衰期为24h，