单纯疱疹病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的单纯疱疹病毒I型(HSV-1)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
【背景技术】
[0002]单纯疱疹病毒在全球分布广泛，人群中极易感染，潜伏和复发感染者较多，患者和病毒携带者都是该病毒的传染源，病毒可通过呼吸道、口腔、皮肤、粘膜的直接接触或性接触途径进入机体，潜居在人体的正常粘膜、血液、唾液以及感觉神经节细胞内。原发性感染多为隐性，大多无临床症状或者呈亚临床表现，仅少数可出现临床症状。HSV-1型的原发感染常局限在口咽部尤以龈口炎最为多见。临床表现为牙龈和咽颊部成群疱疹、发热、咽喉痛，破溃后形成溃疡。此外还可引起脑炎、皮肤疱疹性湿疹。成人可引起咽炎和扁桃体炎。正常人群中约50%以上人为本病毒的携带者。该病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上以及人、猴、鸡等的动物培养细胞中大量地增殖。HSV的动物感染宿主较多，包括家兔、豚鼠及小鼠等实验模型生物。HSV在多种细胞中能增殖，常用原代兔肾、人胚肾细胞以及地鼠肾等传代细胞培养分离病毒。
[0003]新生儿疱疹是临床上常见而又严重的感染，据相关统计死亡率高达50%，存活者中严重损伤者也超过50%。单纯疱疹病毒通过母体产道感染新生儿，包括皮肤、眼和口腔的局部损伤；脑炎；引起死亡的内脏脓毒血症等感染类型。早期抗感染能够有效的减少死亡率。妊娠妇女感染HSV-1型，病毒有可能经胎盘感染胎儿，会影响胚胎细胞的分裂和增殖，使之发生先天畸形。早孕时感染会使流产几率增大3倍，孕晚期感染会使早产明显增多，还会引起宫内发育迟缓、智力低下、小头、小眼、心脏异常、肢体畸形或痉挛性瘫痪、脑发育不良、脑积水等。
[0004]目前，HSV常用的检查有培养法、Real-Time PCR法、血清学检查及其他抗原试验等多种选择。培养法非常耗时，设备要求高，而且只能检查有症状的患者，无症状患者样本中，敏感度较低，不足50%，这使得大部分的HSV感染者直接被漏检，而且无法区分HSV-1与HSV-2 ;细胞学检查，不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，特异性差；酶联免疫法法(ELISA)需要过夜包被抗原，无法达到快速、定量检测的效果；免疫荧光法(IFA)在检查无症状患者样本时，其敏感度在35%?70%范围，结果判断很大程度依赖的临床主观经验。乳胶凝集试验(LA)敏感性较差。核酸检测主要是Real-Time PCR法，需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的检测试剂盒非常必要。
[0005]实时突光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplificat1n and Testing,简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C )，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对单纯疱疹病毒I型(HSV-1)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。
【发明内容】
[0006]目前单纯疱疹病毒I型产品大部分选用单纯疱疹病毒I型的糖蛋白G (US4)的部分基因序列作为检测的靶标序列，作为HSV的保守区域，在此区域设计能够检测，并区分HSV两个亚型(I型与2型);Gen_probe公司曾选用前体mRNA序列(US8.5转录)进行设计，其保守型较好，能有效区分HSV两种亚型，而且在发病前期前提mRNA异常活跃的，有助于病原体的低量检测。但两种方法都有一个共同的问题，GC含量较高。将荧光定量PCR技术应用于HSV-DNA检测的关键技术在于引物和荧光探针的设计，普通探针设计由于GC含量太高(70%以上)，导致探针TM值太高，易形成非特异结合，导致假阳性，大大影响了检测的准确性。而本发明是由发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，选择了 US 5基因的mRNA作为检测靶标，开发出高特异性，高灵敏的专用引物对和探针。其DNA序列保守性较好，GC含量较低(45%左右)，能够有效的避免GC含量过高带来的检测假阳性问题，有效提高检测的准确性，对HSV两个亚型以及其他感染部位相同和症状相似的病毒有较好的区分度。
[0007]本发明的目的是提供一种快速，高灵敏度、高特异性，污染易控，设备简单，成本低的HSV-1 mRNA扩增检测试剂盒。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现:
一种单纯疱疹病毒I型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列I所示的HSV-1的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增的检测引物T7和nT7，和一条用于所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针。
[0009]进一步，所述的试剂盒包含的捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述HSV-1检测引物由Τ7引物和ηΤ7引物组成，Τ7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；所述HSV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3 ’端标记DABCYL淬灭基团。
[0010]再进一步，所述的试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述Τ7引物、ηΤ7引物和检测探针存在于扩增检测液中。
[0011]更进一步，所述的试剂盒还包含有HSV-1内标和内标检测探针；所述HSV-1内标为单纯疱疹病毒I型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用Τ7和ηΤ7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA ;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX突光基团,3’端标记DABCYL淬灭基团,且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。
[0012]具体的，所述的试剂盒包含裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HSV-1扩增检测液、SAT酶液、HSV-1阳性对照、HSV-1阴性对照、HSV-1内标，其中:
裂解液:含硫酸铵(NH4)2SO4和HEPES ；
病毒核酸提取液:含捕获探针和磁珠； 洗涤液:含NaCl和SDS ；
HSV-1扩增检测液:含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HSV-1检测探针和内标检测探针； SAT酶液:含M-MLV反转录酶、Τ7 RNA聚合酶；
HSV-1阳性对照；含单纯疱疹病毒I型US5基因核酸的稀释物或者单纯疱疹病毒I型体外转录RNA的稀释物，所述单纯疱疹病毒I型的体外转录RNA序列为序列8所示；
HSV-1阴性对照:不含有单纯疱疹病毒I型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒I型的溶液；
HSV-1内标:HSV-1 IC RNA的稀释物。
[0013]再具体的，所述的试剂盒中一个反应单位的各种试剂组成如下:
(1)裂解液:25-250mMHEPES，5-50mM (NH4) 2S04 ；
(2)病毒核酸提取液:HEPES250-800mM, LLS 4-10%,捕获探针1_50 μ M，磁珠50_500mg/L ；
(3)洗涤液:HEPES5-50mM, NaCl 50-500 mM, 1% SDS，EDTA 1-1OmM ；
(4)HSV-1 扩增检测液:Tris 10-50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.1-1OmM, NTP l_20mM，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM, HSV-1 引物和探针浓度在 2.5-1OpmoI/ 反应；
(5)SAT酶液:M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应、2-1OmM HEPES pH7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose,40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA,
0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
(6)HSV-1阳性对照:含15-1O8拷贝/mL单纯疱疹病毒I型US5基因核酸稀释液或含单纯疱疹病毒I型体外转录RNA的稀释物；
(7)HSV-1阴性对照:不含有单纯疱疹病毒I型靶标核酸序列或不含有单纯疱疹病毒I型的溶液；
(8)HSV-1 内标:含 14-1O8 拷贝 /mL HSV-1 IC RNA 的稀释物。
[0014]更具体的，所述的试剂盒，其HSV-1扩增检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HSV-1检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。
[0015]更为具体的，所述单纯疱疹病毒I型核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一:
(1)用于扩增HSV-1靶标核酸的HSV-1检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示；
(2)用于与在Τ7RNA聚合酶作用下HSV-1靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1检测探针,所述HSV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示,5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
(3)用于与HSV-1核苷酸成竞争性的内标核苷酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HSV-1内标检测探针，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示,5’端标记HEX突光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0016]本发明提供了一种单纯疱疹病毒I型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有HSV-1检测相比，具有以下优点: (1)本发明试剂盒针对HSV-1的US5基因进行靶标筛选、引物设计，具有高准确度、高特异性，可以实现对拭子、刮取物、脑脊液等样本中的单纯疱疹病毒I型进行快速、准确测定；
(2)本发明试剂盒中加入内标，可进一步有效监控假阴性的存在，提供更准确的检测结果;
(3)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个