一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及幼鱼性腺mRNA原位杂交技术，具体的说是一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位 杂交的方法。
【背景技术】
[0002] 牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国 的重要海水养殖鱼类。牙鲆具有雄鱼比雌鱼生长快、个体大的特点，牙鲆已逐步在性别决定 与分化研究领域成为海水经济鱼类模式物种，研究其性别决定与分化的机制，确定性别决 定与分化相关的基因，并以此为基础，对其实施性别控制，具有重要的理论和实践意义。通 过牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交可以解析性别决定和分化相关基因的表达模式及相互关系， 但是牙鲆幼鱼早期性腺较小、分离困难，而性腺组织较大时期难以直接进行性腺原位杂交， 使得该技术难以应用。因此建立牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法，对于牙鲆性别决定和 分化相关规律的阐述具有重要的意义；另外本发明在其它鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交 进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产 业化生产。
【发明内容】
[0003] 本发明在于提供一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法。
[0004] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0005] -种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法：
[0006] 1)取洗涤后样品经过量浓度为4%PFA溶液固定；固定后用100 %甲醇溶液于-20°C 保存，将上述固定后保存样品经处理作为原位杂交样品；
[0007] 2)上述原位杂交样品进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定而后经洗涤、预杂交，预 杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70°C下杂交过夜；杂交处理后洗涤，并经抗 体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30 %蔗糖沉降；
[0008] 3)上述沉降样品经0CT包埋后进行冰冻切片，进而实现对牙鲆幼鱼性腺mRNA原位 杂交的标记。
[0009] 所述样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长〈60.0_的取其整个腹部;幼鱼 全长>60.0mm直接剥离性腺，取样后无 RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用。
[0010]所述经固定后保存的腹部样品去除多余内脏;经固定后保存的性腺样品的系膜剥 离去除、将性腺切成约5mm。
[0011] 具体待做原位杂交前，将上述固定后保存样品进行进一步处理(腹部样品尽量去 除多余内脏，性腺样品的系膜剥离去除、将性腺切成5_左右大小），以获得原位杂交样品；
[0012] 将原位杂交样品依次经体积比3 : 2和2 : 3的，浓度为100 %甲醇和无 RNA酶的1 X PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min，复水处理后用过量的无 RNA酶的1 X TOST缓冲液洗 涤，洗涤后加入蛋白酶K(10μg/ml)于37°C处理消化10_30min，消化后经过量的4%PFA溶液 再固定20-60min，再固定后经过量无 RNA酶的1 X TOST缓冲液洗涤，洗涤后样品在过量预杂 交液中于50-70°C预杂交2-5h。
[0013] 所述无 RNA酶的1 XPBST缓冲液成分为：136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mM Na2HP04，1 · 76mM KH2P04，0 · 1 (v) % Tween-20，由无 RNA酶水配置，PH7 · 4。
[0014] 所述预杂交液为50(v)%去离子甲酰胺，25(v)%20XSSC(生工，中国），50μg/ml肝 素，500μg/ml酵母tRNA，0.1 (v) %Tween-20，1M的梓檬酸460μ1，加无 RNA酶的水定容至50ml。 [0015] 所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓度为l-2ngAi 1，再将其置于80 °C变性30min，变性后，待用。
[0016] 所述探针为RNA探针，是以在性腺内表达基因的cDNA为模板构建探针载体，在体外 转录合成的带有地高辛标记的、并与该基因的核苷酸序列互补结合的一段单链cRNA分子。 其中，nr5a2、nr0bl、〇7口193、(11]11'1:1、;1；'(?12等性腺发育相关基因均可用来构建并合成1?嫩探 针。
[0017] 样品为根据幼鱼全长不同分别取样，幼鱼全长〈60.0mm的取其整个腹部;幼鱼全长 >60.0mm直接剥离性腺，取样后无 RNA酶的PBS缓冲液漂洗，待用。
[0018] 所述预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70 °C下杂交过夜，然后依次 于50-70°C下用过量的体积比为1:1的不含肝素和酵母tRNA的预杂交液和2XSSC的混合液 洗涤30-60min，洗涤后用过量2 X SSC洗涤30-60min，再用含0.1CHAPS的0.2 X SSC洗涤两次， 每次30-60min;最后在室温下用MAB溶液洗涤5-10min。
[0019] 所述杂交处理洗涤后样品用封闭液于室温下水平摇床封闭2_4h，而后加入碱性磷 酸酶抗体在4 °C孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，再洗涤，20-30 %蔗糖沉降。
[0020] 所述封闭液为含10%羊血清、2%封闭剂的1 XMAB。
[0021] 本发明具有如下优点：
[0022] 本发明在牙鲆幼鱼中运用性腺mRNA原位杂交的技术结合杂交后冰冻切片的方法 来获得相关基因在不同性腺发育时期的表达模式，解决了牙鲆幼鱼早期性腺较小、分离困 难，而性腺组织较大时期难以直接进行性腺原位杂交的难题，将有助于进一步阐述牙鲆性 别决定和分化的相关规律;另外本发明在其它鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交进行基因定 位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
【附图说明】
[0023]图1为本发明实施例提供的牙鲆nr5a2基因在幼鱼(全长〈60.0mm)性腺中的mRNA原 位表达的示意图。其中，nr5a2在全长4cm牙鲆幼鱼(人工雌核发育诱导牙鲆，用雌二醇诱导） 性腺中的表达模式，箭头所指位置是性腺。
[0024] 图2为本发明实施例提供的牙鲜cypl9a基因在幼鱼(全长>60.0mm)卵巢中的原位 表达的示意图。其中，牙鲆cypl9a基因在卵巢中的表达模式，星号所指位置是卵原细胞，短 箭头所指位置是滤泡细胞，长箭头所指位置是卵母细胞。
[0025] 图3为本发明实施例提供的牙鲆dmrtl基因在幼鱼(全长>60.0mm)精巢中的原位表 达的示意图。其中，牙鲆dmrtl基因在精巢中的表达模式，长箭头所指位置是精母细胞，短箭 头所指位置是支持细胞。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例详述本发明的实验步骤。
[0027] 本发明解决了牙鲆幼鱼性腺原位杂交困难的问题，包括幼鱼早期性腺过小难于解 剖获取和性腺组织较大时期难于直接进行性腺原位杂交的问题，本发明的实施能够清晰地 描述牙鲆相关基因在性腺中的定位(mRNA水平），取得了突破性的进展；另外本发明在其它 鱼类幼鱼性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可 以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
[0028] 实施例1
[0029] 丨.取样，洗样。
[0030] 样品为一条全长小于60.0mm的幼鱼取其整个腹部样品；将样品用无 RNA酶的IX PBS缓冲液（1XPBS缓冲液成分为136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mM Na2HP〇4;1.76mM KH2PO4，由无 RNA酶水配置，PH7 · 4)漂洗；
[0031] 2.固定。洗涤以后的上述样品置于无 RNA酶离心管中，样品与浓度为4%的PFA按体 积为1:10混合，而后颠倒混匀以后，平放于4 °C，固定10h。所述PFA由4g PFA溶解于100ml无 RNA酶的1 X PBS缓冲液得到。
[0032] 3.长期保存。将上述固定处理的样品用100%甲醇溶液漂洗两次，而后置换于4% PFA溶液中，置于-20°C长期保存。
[0033] 4.解剖。将上述固定后保存样品尽量去除多余内脏进行进一步处理，以获得原位 杂交样品。
[0034] 5.复水。将上述获得原位杂交样品依次经体积比3:2和2:3的，浓度为100 %甲醇和 无 RNA酶的1 X PBST缓冲液分别进行复水处理30min;洗涤后再用100 % 1 X PBST洗涤四次，每 次30min。
[0035] 6.蛋白酶K消化。经上述复水后得样品用蛋白酶K (1 Oμg/ml)于37 °C处理15min。 [0036] 7 .再固定。经上述消化后样品用4%PFA溶液漂洗一次，再用4%PFA溶液于室温水 平摇床上再固定60min。
[0037] 8 .洗涤。固定处理后在用100 %无 RNA酶PBST漂洗一次，而后再用100 %无 RNA酶 PBST洗涤五次，每次lOmin。
[0038] 9.预杂交。上述洗涤后样品及400μ1预杂交液加入至1.5ml无 RNA酶离心管，于65 °C 杂交炉进行预杂交，预杂交4h。
[0039] 所述预杂交液（以50ml为例）：50(￥)%去离子甲酰胺，25(￥)%20\33(：(生工，中 国），50μg/ml肝素，500μg/ml酵母tRNA，0 · l(v) %Tween_20,1M的梓檬酸460μ1，加无 RNA酶水 至50ml。
[0040] 10.杂交：用预杂交液将探针稀释至终浓度2ngAU，80°C变性30min;每1.5ml离心 管中加入洗涤后所有样品，再加入200μ1变性好的探针，于65°C杂交过夜。
[00411构建nr5a2探针载体的引物序列如下：
[0042] F:5 '-AAGATCCTGGCGTACCTG-3 '
[0043] R:5 '-ACTCGCTCTTTGTCCTTCA-3 '
[0044] 11.杂交后洗涤。
[0045] 1)杂交处理后于65°C下用过量的50(v)%50(v)%预杂交液（不含肝素和酵母 tRNA): 50( v) % 2 X SSC混合液洗涤一次，60min;
[0046] 2)65°(：下用过量的2\33(：洗涤一次，6〇1^11;
[0047] 3)65°(：下用过量的含0.10^?3的0.2\33(：洗涤两次，每次6〇1^11;
[0048] 4)室温下用1 X MAB溶液（1 X MAB溶液为100mM马来酸，150mM NaCl，pH7.5)洗涤一 次，10min〇
[0049] 12.封闭。洗涤后每管加入500μ1封闭液(封闭液为1 XMAB中加入10 %羊血清，2 % 封闭剂(Roche，美国），室温下封闭4h。
[0050] 13.抗体孵育。封闭后加入一抗(按照1:2000用封闭液进行稀释），4°C孵育过夜。
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