一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于临床检验诊断学领域，涉及一种鲍曼不动杆菌快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及临床痰液标本中DNA提取和多重耐药鲍曼不动杆菌快速检测方法。
【背景技术】
[0002]鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii , Ab)是不动杆菌属中最常见的一个菌种，是一种不发酵糖类、革兰染色阴性、无动力的球杆菌，普遍存在于自然界和人体。该菌在医院内分布广泛且可以长期存活，是院内感染重要的条件致病菌之一，可引起呼吸机相关性肺炎(VAP)，泌尿系统感染、菌血症、复杂的皮肤软组织感染、腹膜炎和中枢神经系统感染等。感染多见于免疫力低下的患者，特别是重症监护病房(ICU)病人。
[0003]近年来在全球范围内鲍曼不动杆菌耐药性上升显著。世界各地大量报道了多重耐药鲍曼不动杆菌(mult1-drug-resistance Acinetobacter baumannii , MDR-Ab)和泛耐药鲍曼不动杆菌(extensive drug-resistance Acinetobacter baumannii , XDR-Ab)的爆发流行。MDR-Ab是指对头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷以及β-内酰胺酶抑制剂，这五类抗生素中至少三类耐药的鲍曼不动杆菌;XDR-Ab是指对上述五类抗生素均耐药的鲍曼不动杆菌，但不包括多粘菌素和替加环素耐药;仅针对上述五类抗生素中I类或2类耐药的敏感株鲍曼不动杆菌目前临床已较少见；多/泛耐药鲍曼不动杆菌已成为卫生保健领域的重大课题和21世纪抗感染治疗领域的超级挑战。
[0004]产碳青霉稀酶(oxaci 11 in-hydro Iyz ing，0XA)是鲍曼不动杆菌获得对碳青霉稀类抗生素耐药的主要机制。碳青霉烯酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素酶，本质上仍属于内酰胺酶。根据该酶的分子结构可分为A类、B类和D类。D类酶目前报道最多，按氨基酸同源性又可分为8种，在鲍曼不动杆菌中主要是4种:0ΧΑ23、0ΧΑ24、0ΧΑ51和0ΧΑ58ΑΧΑ酶编码基因多位于细菌染色体或质粒上，由整合子或转座子介导，极易在鲍曼不动杆菌之间发生平行传播。因此鲍曼不动杆菌OXA酶表达情况具有明显的地域性，我国目前报道的鲍曼不动杆菌OXA基因主要有0ΧΑ23、0ΧΑ24和0ΧΑ51([1]许顺姬等，不动杆菌碳青霉烯酶耐药性与0ΧΑ-51基因型研究.现代预防医学[J]，2015.42(5):889-891.;[2]邓德耀等，OXA-51型β内酰胺酶的研究进展.中国感染与化疗杂志[J]，2014.14(5):451-454.; [3]张伟红等，耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药表型和碳青霉烯酶基因型分析.中国感染与化疗杂志[J], 2011.11(1):45-48.)o
[0005]我国由于临床长期经验性和广泛性使用广谱抗生素，造成近年来鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率显著升高，并已从单一抗生素耐药发展成为多重耐药，成为医院感染的重要病原菌之一。国内通常使用亚胺培南+β_内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗鲍曼不动杆菌感染，但目前鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药性已非常严重。对于耐亚胺培南鲍曼不动杆菌治疗则使用替加环素，该药物成本高昂且已发现鲍曼不动杆菌有耐替加环素的趋势，因此临床鲍曼不动杆菌治疗需要科学合理的选择抗生素。目前临床只能通过细菌培养和药敏实验的方法检测鲍曼不动杆菌耐药性，该方法至少需要72 h，远不能适应临床治疗的要求，急需一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法([I ]李玉梅等，医院细菌分离培养及药敏试验结果分析.中国公共卫生[J]，2015.31(3):383-384.; [2]张利元等，医院感染的细菌分布及药敏检测分析.中国现代医学杂志[J]，2012.22(25):86-89.)。
【发明内容】
[0006]本发明实施提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，用于解决临床快速评估鲍曼不动杆菌耐药性，并指导临床合理使用抗生素。
[0007]本发明根据鲍曼不动杆菌0XA24(GeneBank:AJ239129.2)和0XA51 (GeneBank:AJ309734.2)基因序列设计PCR引物，采用多重PCR方法检测100株鲍曼不动杆菌(其中多重耐药菌50株，敏感菌50株)，经检测发现多重耐药鲍曼不动杆菌均表达0XA24基因片段和0XA51基因片段，敏感菌株仅表达0XA24基因；以此建立从临床痰液标本中提取基因组DNA的方法;通过多重PCR快速检测临床标本中鲍曼不动杆及其耐药性。
[0008]其中，针对鲍曼不动杆菌0XA24基因引物序列为:
Ab-0XA24-F(SEQ.N0.ID.I):5 ’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-0XA24-R(SEQ.N0.1D.2):5'-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3 ’；
PCR产物预测长度为246 bp ο
[0009 ] 针对鲍曼不动杆菌0XA51基因引物序列为:
Ab-0XA51-F(SEQ.N0.ID.3):5 ’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，
Ab-0XA5l-RCSEQ.N0.ID.4):5 ’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；
PCR产物预测长度为353 bp ο
[0010]若电泳检测结果含有246 bp(0XA24)和353 bp(0XA51)两个条带则确定为含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246 bp(0XA24)—个条带则确定为含有敏感菌株。
[0011]本发明提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，具体包括如下步骤:
(1)基于鲍曼不动杆菌0XA24和0XA51基因序列设计多重PCR扩增引物；
(2)待检疲液标本或血液标本基因组DNA抽提；
(3)使用步骤(I)所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA;
(4)对PCR结果进行电泳检测。
[0012]其中，步骤(I)中所述的引物序列如前面所述的Ab-0XA24-F(SEQ.N0.1D.1), Ab-0XA24-R(SEQ.N0.1D.2)、Ab-0XA51-F(SEQ.N0.1D.3MPAb-0XA51-R(SEQ.N0.1D.4#；f*。
[0013]其中，步骤(2)中所述的血液标本基因组DNA抽提采用市售全血基因组DNA提取试剂盒即可。
[0014]本发明还提供了步骤(2)中所述的痰液标本DNA快速提取方法，具体步骤包括:在痰液标本中加入等体积浓度为Imo I/L NaOH溶液，于60 °C水浴中放置1 min使痰液充分液化;然后将液化后痰液离心(6000 g，10 min)，收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；加入20 yL 10 mg/mL溶菌酶于37°C静置10 min裂解细菌;再加入20 yL 20 mg/mL蛋白酶K于60°C消化10 min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用酚-氯仿法抽提细菌基因组DNA。
[0015]其中，步骤(3)中所述的多重PCR检测体系包括:12.5 yL的2XPCR Mix预混液、各种引物上下游各0.2 yL(引物浓度均为10 ymol/L)、痰液或血液中提取基因组DNA 2 yL、灭菌双蒸水9.8 yLo
[0016]PCR扩增反应条件为:在94°C下预变性5min后，进行以下扩增循环:在94°C下变性25s，在53°C下退火40s，在72°C下延伸40s，反应进行40个循环后，在72°C下延伸lOmin。
其中，步骤(4)中所述的电泳检测为:通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果若电泳结果含有246 bp(0XA24)和353 bp(0XA51)两个条带则确定为检测出含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246 bp(0XA24)—个条带则确定为检测出含有敏感菌株。
[0017]本发明还提供一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包括:DNA抽提试剂、2对多重PCR扩增引物、2 X PCR Mix预混液、灭菌双蒸水;其中所述2对多重PCR扩增引物如下:
Ab-0XA24-F(SEQ.N0.ID.I):5 ’-GGTTAGT