7-氨基头孢烷酸的制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种7-氨基头孢烷酸的制备方法及用途，特别是涉及利用固定化头 孢菌素 C酰化酶催化头孢菌素 C以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法及用途。
【背景技术】
[0002] 头孢菌素 C(Cephalosporin C, CPC)酰化酶是一步酶法生产7-氨基头孢烧酸 (7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)的一种酰化酶，可以直接催化底物头孢菌素 C，脱 去D- α -氨基己二酸侧链，一步生产7-ACA。与传统的两步酶法相比，一步酶法操作更简单、 方便，成本低，日益受到重视。
[0003] 固定化酶技术产生于20世纪六十年代，目前已广泛应用于生物催化领域的工业 生产中。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高、回收方便、易于控制、可重复使用、成本低 廉等优点，在两步酶法生产7-ACA的生产中的酶制剂采用的即是固定化酶技术（刘秀伟，司 芳，郭林，等.酶固定化研究进展[J].化工技术经济，2003, 21 (4) :12-17.)。
[0004] 在固定化酶的工业应用中，为了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶具 有较好的催化活性和稳定性，可以重复、多批次的使用。因此在固定化CPC酰化酶的开发 中，可以通过酶分子的基因工程改造、采用新型固定化酶载体、对固定化工艺进行改进等多 种手段制备得到酶活高、稳定性好的固定化CPC酰化酶。
[0005] 尽管固定化酶通常具有较好的稳定性等优点，但在固定化酶颗粒内存在较严重的 底物和产物的传质阻力问题（Gao F，Ma G. Effects of Microenvironment on Supported Enzymes. Topics in Catalysis, 2012,55(16-18):1114-1123)〇
[0006] 在通常的利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制备7-ACA的方法中，底物 消耗和产物生成曲线呈现了典型的"前快后慢"特征。这是因为对于固定化CPC酰化酶的 催化来说，和大多数固定化酶的催化类似，反应初始阶段由于较高的底物浓度和较低的产 物浓度（产物经常也是酶的抑制剂），初始的催化速度是最快的；在反应后期由于底物浓度 的降低和产物浓度提高（相应的产物抑制会增强），固定化酶反应速度大大降低。而且，在 实际的生产过程中，这种低速的反应过程占总反应时间的比例很大。
【发明内容】
[0007] 针对这一问题，本发明提出一种利用固定化头孢菌素 C酰化酶催化头孢菌素 C以 一步酶法制备7-氨基头孢烷酸的方法及用途，该方法具有稳定的催化速率、较短的反应时 间和固定化CPC酰化酶能够多批次使用等优点。
[0008] 本发明提供了利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制备7-氨基头孢烷酸 的方法，该方法包括：将固定化CPC酰化酶与CPC在液体中混合，在反应周期内将反应体系 的温度从初始反应温度例如〇_15°C连续地或不连续地逐渐升温至16-37°C，优选20-35°C， 再优选25-35 °C。
[0009] 本发明的上述方法具有以下优点：
[0010] (1)反应周期内固定化CPC酰化酶的催化时间明显缩短而总催化批次并没有减 少，有效地提高了酶的催化稳定性，从而降低生产成本；
[0011] (2)不需要加入其他试剂只需调控温度，生产过程容易操作，无污染。
【附图说明】
[0012] 图1示出了固定化CPC酰化酶在不同温度下的酶活稳定性。
[0013] 图2示出了固定化CPC酰化酶在有或没有7-ACA存在下的热稳定性。
[0014] 图3示出了固定化CPC酰化酶在不同pH值条件下的酶活稳定性。
【具体实施方式】
[0015] 如上所述，本发明提供了利用固定化CPC酰化酶催化CPC以一步酶法制备7-氨基 头孢烷酸的方法，该方法包括：将固定化CPC酰化酶与CPC在液体中混合，在反应周期内将 反应体系的温度从初始反应温度连续地或不连续地逐渐升温至16-37Γ，优选20-35°C，再 优选 25-35 °C。
[0016] 所述初始反应温度为0_15°C，优选3-15°C，更优选5-10°C。
[0017] 所述液体可以是水或常用缓冲液例如磷酸钠缓冲液。
[0018] 固定化CPC酰化酶与CPC的混合方式没有特别的限制，只要得到固定化CPC酰化 酶与CPC的混合溶液即可。例如，可以先将固定化CPC酰化酶和CPC分别分散或溶于水或 缓冲液中，再将二者混合；也可以直接将固定化CPC酰化酶和CPC同时投入水或缓冲液中混 合；还可以将固定化CPC酰化酶直接投入CPC的水或缓冲液溶液中。
[0019] 上述反应周期是指在一个批次的反应中，根据实际生产要求，底物CPC的转化率 为90-99%的反应时间段。
[0020] 所述连续地升温是指在反应周期内温度连续不间断地升高直到反应结束。上述连 续地升温的方式包括以恒定的升温速度的方式和以不恒定的升温速度的方式。所述恒定 的升温速度例如在0. 01°c /分钟-3. 0°C /分钟范围内的任一升温速度，优选0. 05°C /分 钟-2. 0°C /分钟，更优选0. 1°C /分钟-1. 0°C /分钟。在不恒定的升温速度的情况下，优选 先慢后快的升温速度，但是升温的平均速度落入〇. 〇l°C /分钟-3. 0°C /分钟的范围内，优 选0· 05°C /分钟-2. 0°C /分钟，更优选0· 1°C /分钟-1. 0°C /分钟。
[0021] 所述不连续地升温是指在反应周期内的升温间断进行。不连续的升温方式包括多 种，只要在升温过程中发生间断，就包括在上述的不连续升温的范围内。另外，在升温过程 中可以包括有一个或多个降温阶段，只要在反应周期内温度整体来看是上升的即可。上述 不连续地升温的方式包括例如阶梯式升温。
[0022] 所述阶梯式升温包括两阶段升温或更多阶段升温，例如在5-15Γ保持总反应时间 的1/2-3/4然后在20-37°C保持总反应时间的1/4-1/2的两阶段升温，或者在5-15°C保持 总反应时间的1/4-1/2然后在20-25°C保持总反应时间的1/4-2/3然后在28-37°C保持总 反应时间的1/4-1/3的三阶段升温。
[0023] 反应体系的pH值采用常规pH值，例如ρΗ8. 0 ± 1。
[0024] 在本发明的方法中，其它反应条件和参数采用常规实验室或工业生产中所采用的 条件和参数。
[0025] 作为本发明的方法中使用的固定化CPC酰化酶，其可以通过本领域技术人员已知 的方法获得，例如可以商购获得或者通过实验室常规酶固定化工艺获得。举例来说，CPC 酰化酶可以通过微生物例如重组大肠杆菌培养获得；例如，由重组大肠杆菌BL21(DE3)/ pET-CPCacy经过摇瓶培养，超声波细胞破碎，离心，制备而得（Zhu XW，et al.，World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011，27(4) :823-829)。所用的固定化载 体为酶固定化工艺中常用环氧基或氨基载体，例如LX1000-EPC和LX1000-HA，得自西安蓝 晓科技有限公司。
[0026] 作为在本发明的方法中使用的固定化CPC酰化酶可以带有荧光标记，这是通过在 固定化CPC酰化酶上固定荧光物质如5-氨基荧光素钠实现的。
[0027] 本发明的上述技术方案是基于以下研究形成的：
[0028] 在对固定化CPC酰化酶进行研究时，发现CPC酰化酶在低pH条件下的催化稳定性 差，由于固定化酶内底物和产物的扩散问题，随着反应的进行，反应体系中的pH值并不代 表固定化CPC酰化酶中酶本身所处的pH环境。固定化CPC酰化酶颗粒周围和内部微环境 的pH变化情况（也即是酶分子实际所处的pH环境）对酶的催化稳定性影响较大。因此本 申请的发明人针对如何调控才能实现固定化CPC酰化酶所处微环境pH的小幅度平稳变化 做了多种尝试。
[0029] 发明人通过研究发现由于在初始阶段的催化速度最快，大量的酸性产物堆积在固 定化酶周围使得CPC酰化酶的微环境pH与反应体系的pH发生明显的偏移，从而导致CPC 酰化酶的催化稳定性显著下降。同时，发明人还出人意料地发现CPC酰化酶在与产物7-ACA 共存条件下对温度的耐受性明显提高。换句话说，虽然产物7-ACA是CPC酰化酶的反应抑 制剂，但是在高温下却起到对CPC酰化酶的保护作用。
[0030] 基于上述发现，发明人通过调整反应初期的反应温度在较低的温度范围内，使得 产物7-ACA的生成没有那么快，从而使得固定化CPC酰化酶所处的微环境的pH变化没有那 么剧烈，从而保护了 CPC酰化酶的催化稳定性。随着7-ACA在反应体系内的浓度的提高，由 于CPC酰化酶在与产物7-ACA共存条件下对温度的耐受性明显提高，可以逐渐提高反应温 度，使得反应时间缩短，而且还不影响CPC酰化酶的催化稳定性，使得固定化CPC酰化酶的 催化批次不受大的影响。
[0031] 实施例
[0032] 以下通过实施例更详细地描述本发明。但是本发明的范围并不局限于实施例。
[0033] 实施例中的分析方法：
[0034] (1)律立产物7-ACA的标准曲线:
[0035] 1)用0· lmol/L、pH8. 5的磷酸钠缓冲液分别配制20mg/mL的CPC溶液和3mg/mL的 7-ACA溶液，并用lmol/L的NaOH溶液调其pH至8. 5〇
[0036] 2)分别取0、1、2、4、8、12、16、2(^1^7-厶〇厶溶液加入到离心管中，再用0.1111〇1/1、 pH8. 5的磷酸钠缓冲液逐一补足到20 μ L。
[0037] 3)分别向各管中加入20 μ L CPC溶液（37°C预热3min)并混勾，37°C静置5min后 加入200 μ L终止液（50mmol/L的NaOH溶液与20 %的冰醋酸溶液按1:2的体积比混合而 成），并震荡充分混匀。
[0038] 4)将上述混合液12000rpm离心3min，然后各取200 μ L上清液到新的离心管中， 再加入40yL显色剂（对二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液（0.5%，w/v))并混匀，室温静置 lOmin后，各取200 μ L，以加入0 μ L7-ACA溶液的样品为空白对照，分别测定其它几个样品 在415nm处的吸光度值（采用上海精密科学仪器有限公司生产的722S型可见光分光光度 计进行测定）。
[0039] 5)以7-ACA浓度为横坐标，0D415为纵坐标绘制标准曲线。
[0040] ⑵固宙化CPC酰化酶的酶活测宙：
[0041] 1)称取质量为10mg-100mg的固定化酶于37°C预热3min。
[0042] 2)加入37°C预热的0. lmol/L、pH8. 5的磷酸钠缓冲液分别配制20mg/mL的CPC溶 液 4mL〇
[0043] 3) 37°C、160rpm 反应 5min。
[0044] 4)取20 μ L上清液进行适当稀释，加入200 μ L终止液，混匀。
[0045] 5)将上述混合液12000rpm离心3min后取200 yL上清液到离心管中，再加入 40 μ L显色剂并混勾，室温静置lOmin后，取200 μ L测定其在415nm处的吸光度值（采用上 海精密科学仪器有限公司生产的722S型可见光分光光度计进行测定）。
[0046] 6)通过标准曲线计算7-ACA浓度，最终计算出固定化CPC酰化酶的活性。
[0047] CPC酰化酶活力的定义：在37°C、ρΗ8· 5、以20mg/mL的CPC溶液为底物的条件下， 每分钟催化CPC生成1 μ m〇17-ACA所需的酶量为1个活