梨蔗糖转运蛋白基因PbSUT2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种从鸭梨（Pyrus bretschneideri) 果实中分离、克隆得到一个编码蔗糖转运蛋白的基因 PbSUT2,还涉及一种梨蔗糖转运蛋白 基因 PbSUT2在调节植物生长与果实品质方面的应用。
【背景技术】
[0002] 梨是世界重要水果之一，也是我国的第三大栽培果树。糖是果实其他品质特征 成分和风味物质如有机酸、花色素和芳香物质等合成的前体，是联系植物初级代谢和次级 代谢的关键物质；同时，糖也具有多种多样的生物学功能，如为果实的细胞膨大提供渗透 推动力，以及作为信号分子与激素等信号连成网络，其通过复杂的信号转导机制调节果实 生长发育与基因表达等（Leon and Sheen，2003;陈俊伟等，2004)。蔷薇科植物果实中积 累的糖分主要为蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇等四种糖（Yamaki et al.，1986)。梨果实中 糖组分和积累特点因不同种类及品种存在显著差异（Hudina and Stampar，2000 ;Chen et al.，2007 ;姚改芳等，2010)。植物叶片产生的光合运转糖需经短距离运输到韧皮部并装 载入韧皮部，经筛管长距离运输后从韧皮部卸出；再由韧皮部后运输进入果实代谢和贮藏。 库细胞中韧皮部后运输效率，糖代谢酶的种类与活力和糖的跨膜运输能力等因素决定了果 实糖分的积累（Ruan and Patrick，1995)。因此，筛选果实蔗糖运输过程中的转运蛋白基 因，有助于了解梨蔗糖转运蛋白参与的糖运输分子生理机制及糖信号转导耦合激素信号转 导调控植株生长发育的过程，为利用基因工程的手段改善果实品质的研究提供新的基因资 源。
[0003] 植物的鹿糖转运蛋白（sucrose transporters，SUTs)，又称鹿糖_H+共转运蛋白 (sucrose/H+co-transporters，SUCs)，是一类具有鹿糖转运活性的鹿糖载体，广泛存在于 高等植物的组织和细胞中介导蔗糖的跨膜运输。因此，蔗糖转运蛋白被认为在蔗糖进出韧 皮部、库组织的蔗糖供给与蔗糖的贮藏，以及蔗糖转运调控等多种生理过程中发挥着重要 的作用。Riesmeier等（1992)从菠菜中克隆得到了第一个鹿糖转运蛋白SoSUTl(Riesmeier et al·，1992)。鹿糖转运蛋白属于 MFS 超家族（Major Facilitator Super family)中的 一员，它们的序列高度保守，是高疏水性蛋白，含有12个跨膜结构域，中间面向细胞质 的部分有1个大的胞质环，将蛋白分为各含6个跨膜结构域的2个半区，即前半区和后半 区。至今已经从菠菜、马铃薯、芹菜、胡萝卜及拟南芥等植物中克隆得到了 80多种蔗糖转运 蛋白基因（张立军等，2008)。而后又对这些基因和cDNA序列进行同源性和系统发生分析 得知，编码鹿糖转运蛋白的基因属于一个多成员的基因家族（Ward et al.，1998 ;KUhn et al.，1999;Williams et al.，2000)。在大多数植物体中，都包含不止1个蔗糖转运蛋白基 因。如拟南芥中包含9种鹿糖转运蛋白基因 （The Arabidopsis genome initiative, 2000)， 水稻基因组中包含5种蔗糖转运蛋白基因 （Aoki et al.，2003)。甜橙中有3个蔗糖转运 蛋白基因 （Zheng et al.，2014).植物体的蔗糖转运蛋白共分为5个亚族：SUT1、SUT2、 SUT3、SUT4和SUT5亚族（KUhn et al.，2010)。代谢库特异性的蔗糖转运蛋白也从许多 植物中分离得到，如葡萄的 VvSUCll 和 VvSUC12(Davies et al.，1999)，甘蔗 ShSUTl(Rae et al.，2005)，拟南芥花 AtSUC9(Sivitz et al.，2007)，拟南芥胚柄 AtSUC3(Stadler et al·，2005)，拟南芥胚乳 AtSUC5 (Baud et al·，2005)等。
[0004] 不同类型的鹿糖转运蛋白其功能上存在差异。Leggewie et al (2003)研究得出马 铃薯的蔗糖转运蛋白基因 SoSUTl超表达后，改变了植株叶片和块茎的蔗糖含量，但对块茎 的代谢和形态学影响很小。StSUT4影响马铃薯植株的开花，块茎的产量以及对光的敏感性 (Chincinska et al.，2008)。马铃薯块茎中StSUTl的表达量减少后，不影响其地上部分的 器官，但会减少块茎早期发育过程中块茎鲜重的积累（KUhn et al，2003)。Li et al (2014) 从基因型为'TAS-R8'的可可植物中克隆得到6个TcSUT基因（TcSUTl-TcSUT6)，其分属3 个不同的亚簇，各自具有不同的表达模式。拟南芥AtSUCl的突变体在外源提供蔗糖和麦芽 糖的条件下，其花青素积累量减少，许多与花青素合成有关的重要基因表达量下降（Sivitz et al.，2008);拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUC2突变体增加了蔗糖的韧皮部渗漏和转运的时 间（Gould et al, 2012)。AtSUC9突变体在短日照的条件下表现出早花的表型（Sivitz et al.，2007)。AtSUC5基因与拟南芥种子的早期发育有关（Baud et al.，2005)。杨树的蔗糖 转运蛋白基因 PtaSUT4调节整个植株的水分关系（Christopher et al.，2012)。烟草的蔗 糖转运蛋白NtSUT4影响原生质体细胞的形状，这种影响是通过细胞内蔗糖的体内平衡途 径实现的（Okubo-Kurihara et al.，2011)。Hackel et al(2006)通过反义抑制番前鹿糖 转运蛋白LeSUTl和LeSUT2的研究得出，LeSUTl和LeSUT2通过不同的途径影响番茄果实 的发育。葡萄植物中与成熟相关的2个蔗糖转运蛋白VvSUCll和VvSUC12可促进蔗糖从质 外体到薄壁细胞的装载的功能（Manning et al.，2001)。
[0005] 目前有关植物蔗糖转运蛋白的功能研究主要集中拟南芥、烟草、番茄等植物，而有 关梨的蔗糖转运蛋白的报道较少，虽然目前已克隆得到了梨蔗糖转运蛋白有PbSUTl (Zhang et al.，2013)和PpSUT2(Tang et al.，2014)，但还未见有对梨蔗糖转运蛋白或果树植物蔗 糖转运蛋白的功能研究的相关报道。梨蔗糖转运蛋白是如何调控和影响植物的生长发育， 对果实的品质又有何影响，这些问题都需要进行深入的研究和探讨。因此，本研究开展了新 的梨蔗糖转运蛋白基因的克隆和功能的研究，将对了解果实蔗糖转运的分子生理机制及品 质育种研究具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供了一种从梨（Pyrus bretschneideri)果实中分离克隆的 蔗糖转运蛋白基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供该基因在果实品质方面的应用。
[0008] 为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 申请人从梨（Pyrus bretschneideri)果实中分离克隆得到一个新基因 PbSUT2， 其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，编码区序列（⑶S)长度为1497bp，编码499个氨 基酸残基，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示，预测编码蛋白质含有12个跨膜结构域， 分子量为53. 42KD，等电点为8. 96。
[0010] 克隆本发明所述PbSUT2基因 CDNA序列的引物对，正向引物 PbSUT2-Fl:5'-CCATGCCAGCTCCAGAAG-3'（SEQ ID N0.3);反向引物 PbSUT2-Rl: 5'-ACCTCATGTGACAGCTCTGG-3'（SEQ ID N0.4)。
[0011] 含有本发明所述的蔗糖转运蛋白基因 PbSUT2的重组表达载体。
[0012] 本发明所述的蔗糖转运蛋白基因 PbSUT2在提早植物开花中的应用。
[0013] 本发明所述的蔗糖转运蛋白基因 PbSUT2在提高植物果实蔗糖含量中的应用。
[0014] 本发明所述的蛋白在提早植物开花中的应用。
[0015] 本发明所述的蛋白在提高植物果实蔗糖含量中的应用。
[0016] 本发明所述的重组表达载体在提早植物开花中的应用。
[0017] 本发明所述的重组表达载体在提高植物果实蔗糖含量中的应用。
[0018] 利用qRT-PCR技术分析了在鸭梨果实发育过程中PbSUT2基因的表达模式，结果表 明PbSUT2在整个果实发育过程中都具有表达量，其相对表达量的最高峰出现在果实快速 膨大期，其次是果实成熟前期，这与蔗糖的积累规律相一致。
[0019] 构建了 PbSUT2的亚细胞定位融合表达载体pCAMBIA1302-PbSUT2-GFP，通过农杆 菌介导转化洋葱表皮细胞，结果表明PbSUT2定位于细胞膜上，属于膜蔗糖转运蛋白体。
[0020] 构建梨PbSUT2基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将梨 PbSUT2基因转化番茄，获得的转基因植株经生物学功能分析，表明本发明克隆的PbSUT2基 因具有提早番茄植物开花结实的功能，在果实的糖积累过程中促进蔗糖的显著积累，提高 成熟果实中蔗糖的比例。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明利用转基因技术得到早花和果实 蔗糖含量提高的植株，突破了传统育种手段的障碍，为植物果实品质基因工程提供了重要 的基因资源。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明技术路线图。
[0023] 图2梨PbSUT2编码蛋白拓扑结构示意图。
[0024] 图3为本发明克隆的梨PbSUT2基因在鸭梨果实发育过程中的qRT-PCR分析和梨 果实发育过程中糖分含量变化。a :PbSUT2的相对表达量；b:鸭梨果实含糖量。
[0025] 图4为本发明克隆的梨PbSUT2基因亚细胞定位载体图。
[0026] 图5为本发明克隆的梨PbSUT2基因的亚细胞定位。明场（A，D)，暗场（B，E)，叠 加（C，F)。（A，B和C)对照空载GFP表达情况；(D，E和F) PbSUT2-GFP融合表达载体的定位 图。
[0027] 图6为本发明克隆的梨PbSUT2基因在转基因番茄成熟果实中的表达量分析图。 WT :成熟果实；#45、#62、#76 :阳性转PbSUT2基因番茄株系。
[0028] 图7为本发明克隆的梨PbSUT2基因的植物超表达载体构建流程图。
[0029] 图8为本发明克隆的梨PbSUT2基因在番茄植株中过量表达对植株生长的影响。 WT :野生型番茄植株；#45、#62 :阳性转PbSUT2基因番茄株系。a:转基因植株提早开花；b : 转基因植株提早结果；c :转基因植株果实提前成熟。
[0030] 图9为本发明克隆的梨PbSUT2基因在番茄植株过量表达对叶片净光合速率的影 响。WT :野生型番茄植株；#45、#62 :阳性转PbSUT2基因番茄株系。不同小写字母表示转 PbSUT2基因株系与野生对照的植株叶片净光合速率的差异达到显著差异（P < 0. 05)。
[0031] 图10.为本发明克隆的梨PbSUT2基因在番茄植株过量表达对果实可溶性糖含 量的影响。WT :野生型番茄植株；#45、#62 :阳性转PbSUT2基因番茄株系。（a):蔗糖含量 (mg · g VW) ; (b):葡萄糖含量（mg · g VW) ; (c):果糖含量（mg · g心）；（d):可溶性总糖含 量（mg · g tW)。不同小写字母表示转PbSUT2基因株系与野生对照的植株果实含糖量的差 异达到显著差异（P < 0. 05)。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实