一种牙鲆原始生殖细胞dead end基因及其的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及牙鲜Dead end序列，具体的说是一种牙鲜原始生殖细胞dead end基因 及其的应用。
【背景技术】
[0002]牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国 的重要海水养殖鱼类。牙鲆的快速生长能够提高养殖效率，并减少长时间养殖过程中的各 种风险。通过遗传育种技术获得快速生长的品系需要较长的时间。如何利用小分子物质促 进其生长未见报道。
[0003] Dead end(Dnd)是脊椎动物特有的生殖质成分，是原始生殖细胞(PGCs)及性腺生 殖细胞的标记基因，其参与了PGCs的发生、发育、迀移、存活等功能，对PGCs的发育及其脊椎 动物的配子生成至关重要。它编码RNA结合蛋白，该蛋白含有6个保守的结构域，一个C端结 构域，一个RRM(RNA Recognize Motif),四个N端结构域。至今为止尚未见其对生长的影响 的报道。
[0004] RNA干扰技术是近些年来发展起来的一种阻抑基因表达的方法，可以特异性剔除 或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能以及表达调控等方面。该技术 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的dsRNA，宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其 胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21 ~23bp)，即siRNA，最终诱导靶基因的mRNA降解，从而达到阻抑基因的表达，进而出现基因 的功能缺失。
【发明内容】
[0005] 本发明在于提供一种牙鲜原始生殖细胞dead end基因及其的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 一种牙鲜原始生殖细胞dead end基因，牙鲜Dead end基因为SEQ ID No. 1中所示。
[0008] 一种基于牙鲜原始生殖细胞dead end基因的siRNA，所述基于牙鲜Dead end基因 的siRNA为20-50bp的siRNA。
[0009] 所述siRNA的Sense(5 '-3 '）序列为：CCACCUGAGGGUUCUGCGUG;Antisense(5 '-3 '）序 列为:CACGCAGAACCCUCAGGUGG;
[0010] 或，以上述siRNA序列为核心序列在5'端和/或3'添加不同碱基或者其它核苷酸类 似物等获得。
[0011] 一种基于牙鲜原始生殖细胞dead end基因的革E1基因应用，所述根据SEQ ID No. 1 中所示的核苷酸序列的20_50bp siRNA靶基因在促生长中的应用。
[0012] 所述根据SEQ ID No.l中所示的核苷酸序列的20-50bp siRNA祀基因在鱼类中促 生长中的应用。
[0013] 所述鱼类为牙鲆。
[0014] 本发明的优点：
[0015] 本发明是首次在牙鲆中发现Dead end(Dnd)的序列，并证实以该序列为靶基因合 成的siRNA有促进生长的作用，因而该序列及相关的siRNA在鱼类包括海水鱼类促进生长的 应用中具有极大的价值，这为鱼类包括海水鱼类促生长相关研究提供了基础技术保证。
[0016] 同时，本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以促进牙鲆等海水鱼生长。
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例提供的靶基因 s iRNA抑制目的基因表达图，其中，Μ，DNA标准； Ρ1-Ρ9，25bp的SiRNA注射组;B，PCR空白对照;C1-4，对照SiRNA注射组。
[0018] 图2为本发明实施例提供的靶基因 siRNA促进生长的分析图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例详述本发明的实验步骤。
[0020] 本发明在牙鲆中获得Dead end(Dnd)的序列如SEQ ID No.l中所示。以所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列为靶序列合成siRNA促进牙鲆生长的应用。本发明基因序列为牙 鲆特有的序列，可以促进牙鲆生长。
[0021] 实施例1
[0022] 1.RNA 提取
[0023] 牙鲜性腺的总RNA提取采用Trizol (Invitrogen)提取，具体步骤如下：取大约 0 · lmg牙鲜性腺，加入0 · lmL Trizol，充分混勾，然后加入Trizol 0 · 9mL，室温放置5min。加 入氯仿〇. 2mL，剧烈振荡15s，室温放置3111；[11。12000 Xg，4°C，离心15min，离心后将离心管小 心取出。取上清到新的离心管中，加入等体积异丙醇，混勾，室温放置l0min，12000 Xg，4°C， 离心10min。去掉异丙醇，加入预冷的75%乙醇lmL洗涤沉淀，7500 Xg，4°C，离心5min。去掉 乙醇，置于超净台中使乙醇挥发。加入水(无 RNA酶)30yL，55-60 °C水浴1 Omin使RNA溶解，取 出后置于冰上。加入lyL DNase(无 RNA酶），37°C水浴15min，消化DNA以去除DNA的残余。取出 后置于冰上，1此电泳检测质量及完整度，测吸光度检测浓度及质量。直接用于余下实验，或 者液氮速冻，-80 °C保存 [0024] 2.CDNA合成及检测
[0025] 取上述获得性腺总RNA 2ug及lul oligo d(T)加入灭过菌的PCR(无 RNA酶）中，放 入PCR仪70°C，5分钟，取出立即置于冰上，加入5.0yL 5X反转录酶缓冲液，5.0yL dNTP Mix (10mM)，1.0yL RNase抑制剂（RNase InhibitoiOHOU/yLhI.OyL m-mlv反转录酶，并用水 (无 RNA酶)补至25ul，轻轻混匀，42 °C温育60min。
[0026] 用牙鲆β-actin基因作内参PCR检测cDNA，PCR所用引物如下：5'端引物5'_ ACTACCTCATGAAGATCCTG-3 '，3 ' 端引物5 ' -TTGCTGATCCACATCTGCTG-3 '
[0027] PCR混合物体系如下：
[0029] PCR按照如下程序进行：94°C 5min;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30min，反应30个循 环;72°C lOmin，4°C+〇〇 ;反应结束后取出5yL在1.0 %的琼脂糖电泳检测，发现PCR产物中为 500bp左右的片段。
[0030] 3.Dnd 的获得。
[0031 ] PCR所用引物如下：（1) 5 ' 端引物5 ' -CACCTGAGGGTTCTG- 3 '，3 ' 端引物5 ' -TACAACAACCAGTGATCCGAGTG-3，
[0032] PCR混合物体系如下： 「nnWI
L〇〇34j PCR按照如卜程序进仃：94UC 5min;94uC 30s，55uC 30s，72uC lmin，反应45个循 环;72 °C lOmin，4°C 〇〇 ;反应结束后取出5yL在1.0 %的琼脂糖电泳检测，发现PCR产物中含 700左右的片段，然后将剩下的产物(约45μυ通过胶回收的方法回收其适当的片段。
[0035] PCR产物的回收采用胶回收试剂盒(康为公司）进行，具体方法如下：制备大孔的琼 脂糖凝胶，将回收用PCR反应液加入点样孔内，100V电压恒压电泳，使电泳条带分离效果达 到最佳为止。在紫外灯下切下目的片段所在琼脂糖块放入1.5mL离心管中。按每lOOmg琼脂 糖加300yL S1液的比例加入S1液，置50°C水浴lOmin，使琼脂糖块完全溶化。每2min颠倒混 匀一次。将琼脂糖溶化后的溶液移入吸附柱，离心30s。倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入 收集管。
[0036]在吸附柱中加入500yL W1液，离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。 在吸附柱中加入500yL W1液，静置lmin后，离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集 管。离心lmin。将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入20uL EB液， 37 °C 5min后，离心lmin，取3yL回收溶液电泳检测回收