一种聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂hs-1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，尤其是涉及一种具有整合素亲和性和结合能力、具有 肿瘤靶向性的聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1及其应用。
【背景技术】
[0002] 研究表明，新生血管的生成对肿瘤的生长有着重要的影响，新生血管可以为实体 瘤提供其生长所需的氧气、营养以及帮助其排泄代谢产物，同时还为其能够远处转移提供 途径。所以，阻断新生血管生成可以有效的阻止肿瘤的生长及转移。所以研制出能够抗血管 生成分子的药物得到了广泛的共识。
[0003] 与传统抗肿瘤药物相比，肿瘤血管生成抑制剂有着诸多优点，比如其可以靶向选 择性的作用于血管内皮细胞，对于机体的毒副作用小。再者靶点细胞为血管的内皮细胞，药 物能够轻易的与血液中与之接触发生作用。肿瘤的血管内皮细胞很少发生突变，所以对药 物不易产生耐药，可以长期用药。同时该方法可以与化疗方法联合应用并减轻其带来的副 反应程度。
[0004] 目前，国际上开发出的整合素阻断剂已经入II期临床，而我国还尚未有相似或同 类产品进入市场，所以对于开发我国自主知识产权的此类药物非常有必要。整合素受体 (Integr in)为细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基 质(ECM)之间的相互作用，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。整合素受体是由α和β亚 基以非共价键结合而形成的跨膜异二聚体糖蛋白，属于I型膜蛋白，迄今已发现由18种不同 的α亚基和8种β亚基组成的24种整合素。内皮抑素是能够抑制内皮细胞增殖的一类血管生 成抑制剂。内皮抑素是胶原XVIII的C-端片段，分子量为20kDa，能够特异性抑制内皮细胞的 增殖和迀移，减少胶质细胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各种原发肿瘤。内皮抑素能够与整 合素 α5β1相互作用，预示着α5β1可能是endostatin的功能革巴点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1及其应用，聚乙二 醇修饰后的HS-1可在不影响其体内外活性的同时，有效延长HS-1的半衰期，是一种新型分 子，与修饰前的分子相比，活性产生不同的效果。经过修饰后，药物的给药频率降低，药物对 肿瘤生长抑制的作用时间延长，拓展了社会价值和经济价值。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] -种聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1。
[0008] 优选的，所述聚乙二醇的分子量为20000,氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示，为 mPEG-SC20k-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp〇
[0009] 本发明的另一方面，一种聚乙二醇修饰的HS-1的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 1)、合成HS-1 :a、称取Fmoc-Ser-Wang resin倒入玻璃砂芯反应柱中，加入二氯甲 烷使树脂膨胀;b、加入六氢吡啶/DMF脱帽；c、洗涤:将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂，抽干，取 树脂放置到小试管内，加入验色剂，加热；d、缩合:称取保护氨基酸和HOBt，溶于DMF和DIC， 倒入反应釜中反应;e、洗涤:将反应液抽干，用DMF洗涤树脂，抽干，取树脂置于小试管内，加 入验色剂，加热;f、切肽:把抽干的树脂装入圆底烧瓶中，加入切割液，密封反应，将树脂与 多肽分离;g、后处理:先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，离心，把清液倒掉，然后再用无 水乙醚洗涤多肽，抽干得多肽粗品；
[0011] 2)、纯化HS-l:a、溶解:称取ID-18粗品，加入纯化水配置成溶液，超声搅拌至无颗 粒状澄清溶液;b、过滤:将ID-18的溶液用沙芯过滤器过滤;c、制备:一次纯化;d、平衡:冲洗 制备柱;上样:用输液栗上样，并采集基线，检测是否有样品冲出；
[0012] 3)、聚乙二醇修饰多肽：按照摩尔比为1.5:1，分别称取TOG和HS-1，置于配好的 PH5-8.5的PBS缓冲溶液中，过夜反应；
[0013] 4)、分离纯化:a、分离:对反应后的样品应用半制备型高效液相进行纯化在目的峰 出峰过程中，用离心管收集产物;b、纯化:将经过HPLC收集的产物首先于-70°C低温冰箱预 冻过夜，之后于提前遇冷的冷冻干燥机冻干，直到目测全为白色粉末为止，收获冻干产物。
[0014] 本发明的另一方面，聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1在实体肿瘤治疗中的应 用。
[0015] 优选的，聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1可用于乳腺癌和宫颈癌的治疗。
[0016] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0017] 1、本发明的聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1具有抑制肿瘤新生血管形成，抑 制肿瘤生长和转移的效果。
[0018] 2、本发明的聚乙二醇修饰的血管生成抑制剂HS-1毒副作用少、用量少、成本低。说 明本发明设计的聚乙二醇修饰的整合素阻断剂多肽科学、合理、可行有效，能作为制备治疗 人类实体肿瘤的治疗药物，为将来药物开发提供了新的思路，具有显著的社会价值和市场 价值。
[0019] 3、聚乙二醇修饰后的血管生成抑制剂HS-1的靶点不变，延长多台分子的体内半衰 期、降低清除率、降低了免疫原性和抗原性，并且抗肿瘤活性保持不变，但是降低了给药频 率，修饰后原来每天给药一次，变为每2-3天给药一次。
【附图说明】
[0020] 图1是血管抑制剂多肽对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用。 [0021]图2是血管抑制剂多肽对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用。
【具体实施方式】
[0022] 一、整合素阻断剂HS-1的制备
[0023] Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp的固相合成方法，其以Fmoc-Ser-wangresin或Fmoc-Ser-CTCresin为起始原料，然 后用保护氨基酸依次接二肽至十九肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得 HS-1粗品。将粗品进行纯化，首先溶解，然后用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻 干得到纯品。具体步骤如下：
[0024] 1、合成：
[0025] 称取Fmoc-Ser-Wang resin 14.7g，倒入1L的玻璃砂芯反应柱中，加入CH2Cl2l47ml 使树脂充分膨胀。
[0026] 脱帽：加入六氢吡啶/DMF的脱帽液25ml，密封后放入振荡器中反应5分钟，温度控 制在室温，5分钟后将脱帽液抽干，中间用DMF洗涤一次，然后再加入一次20 %的脱帽液25ml 反应15分钟。
[0027]洗涤:将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂6次，抽干，取20颗树脂在小试管内，加入验色 剂，在115°C加热3分钟。
[0028] 缩合：称取保护氨基酸和HOBt 2.025g，溶于15ml DMF和2.33ml DIC，然后倒入反 应釜中反应1.5左右小时，温度控制在34°C左右。
[0029] 洗涤:将反应液抽干，用DMF洗涤树脂3次，抽干，取10-20颗树脂在小试管内，加入 验色剂，在115 °C加热3-5分钟。
[0030] 切肽:把抽干的树脂装入500mL的圆底烧瓶中，加入300mL 90%的切割液(按体积 比比计三氟乙酸：苯酸:苯甲硫醚:EDT = 90: 3:3: 2: 2)，密封反应2小时，用砂芯漏斗将树脂 与多肽分尚。
[0031] 后处理:先加无水乙醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用 无水乙醚洗涤多肽6次，抽干得多肽粗品9.5g。
[0032] 2、纯化：
[0033] 溶解:精密称取ID-18粗品，加入适当的纯化水配置成10g/l的溶液，超声搅拌至无 颗粒状澄清溶液。
[0034] 过滤:将ID-18的溶液用沙芯过滤器0.45um的混合滤膜过滤.
[0035] 制备:一次纯化
[0036] 平衡：制备柱用5%乙腈+95%三氟乙酸水溶液，流速80ml/min冲洗lOmin。
[0037]上样：用输液栗上样，流速80ml/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于 200mv的溶液，检测是否有样品冲出。
[0038]二、聚乙二醇修饰多肽的步骤
[0039] mPEG-SC20K 与 HS-1 的反应：
[0040]分别称取 2gmPEG-SC2〇K 和106 · 24mgHS-l (摩尔比为1 · 5:1)置于 40ml-100ml 配好的 PH5-8.5的PBS缓冲溶液中在4°C条件下过夜使其进行反应，PEG-SC500-20000都可进行连接 反应合成修饰多肽。
[0041 ] 三、分离纯化步骤
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