一组用于粪肠球菌实时荧光pcr检测的特异性引物和探针的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测方法技术领域，具体设及一组用于粪肠球菌实时巧光PCR 检测的特异性引物和探针。
【背景技术】
[0002] 肠球菌属是人和动物肠道内的正常寄居菌，是医院感染的重要病原菌。在革兰阳 性球菌所致的感染中，位居第2位。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)EF是革兰氏阳性、过 氧化氨酶阴性的球菌，是人和动物肠道内的主要菌群。该菌可引起群体致病和医院交叉感 染，临床上表现为尿路感染、菌血症、屯、内膜炎等，加之粪肠球菌对多种抗生素都有耐药 性，因而越来越受到人们的关注。在人医方面，有85%~90%的肠球菌感染归因于粪肠球 菌。同样，粪肠球菌对动物养殖业的影响亦不可忽视，国内已有粪肠球菌引起羊和猪发生 严重疾病的报道。因此，迅速、准确地鉴定粪肠球菌对控制感染和流行病学研究有很大帮 助。
[0003] 由于EF广泛存在，为肠道内的正常寄居菌，对于大多数实验室来说，鉴定肠球菌 的优先方法就是依赖于表型进行鉴定。然而，各项研究表明，因为多种肠球菌间的表型和 生化特性相似，所W基于表型的方法得出的结果往往比较模糊，且表型的方法需要数天 才有结果。用免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫巧光法及酶联免疫吸附试验等 方法检测EF的结果尚不理想。近年来发展起来的实时巧光定量PCR( Fl Uore seen Ce quant;Uative PCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，实现了PCR技术从定性到定 量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题，它相对常规PCR技术先进、操作简 便，实现了实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷 等优点。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于设计一组粪肠球菌特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用 于EF检测的快速、灵敏、特异性好的巧光定性或定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆 技术，将粪肠球菌16S RNA基因片段插入到载体PMD18-T中，获得含有16S基因片段的重组质 粒，W此作为标准品。根据粪肠球菌16S的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引 物和探针，优化PCR反应条件，建立W实时巧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对 所建立的方法进行评估。
[0005] 本发明通过W下技术方案予W实现： 本发明的第一个目的是提供一组用于粪肠球菌实时巧光PCR检测的特异性引物和探 针，所述特异性引物和探针的核巧酸序列为(1)或(2)中的一种： (1)、上游引物：5 ' -TTCGCACCAGGAGATAAA-3 ' 下游引物：5 ' -GCTGAATTGGCAGAGGAC-3 ' 探针：5 ' -TTTTTCCCAGTTCACTGCCG-3 ' 所述引物和探针扩增的目标核巧酸序列参见序列表中SEQ ID No.3; (2)、与（1)所述序列互补的序列。
[0006] 作为优选，所述探针的5'端巧光报告基团是FAM，3'端标记的是巧光泽灭基团 TAMRAo
[0007] 本发明的第二个目的是提供粪肠球菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为粪肠球菌 的定性或定量检测试剂盒;所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针； 作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为:将粪肠球菌 保守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有粪肠球菌 保守基因片段的重组质粒，W此作为标准品;所述粪肠球菌保守基因片段参见序列表中SEQ ID No.2； 作为进一步优选，所述粪肠球菌保守基因片段是W序列表中SEQ ID No. 1的核巧酸序 列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的： 上游引物：5 ' -CGTTGGACGACCCACAC-3 ' 下游引物:5 ' -CCACCGCAAGCATAAGA-3 ' ； 作为优选，所述PCR扩增的条件为:94°C预变性5min;94°C 30s、60°C 30s、72°C Imin, 35个循环；72 °C IOmin。
[0008] 本发明的第=个目的是提供上述特异性引物和探针在制备定性或定量检测粪肠 球菌的试剂盒中的应用。
[0009] 作为优选，所述应用是分别W标准品和待测样品CDNA为模板，利用特异性引物和 探针进行实时巧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。
[0010] 作为优选，所述实时巧光定量PCR的反应条件为:94°C预变性2分钟，94°C 15秒、 60°C 40s并收集巧光信号，40个循环。
[0011] 本发明的第四个目的是提供粪肠球菌的实时巧光定量PCR检测方法，所述检测方 法不W有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下： (1) 制备标准品：将粪肠球菌保守基因片段插入到载体PMD18-T中，转化至大肠杆菌中 进行诱导表达，获得含有粪肠球菌保守基因片段的重组质粒，W此作为标准品;所述粪肠球 菌保守基因片段参见序列表中SEQ ID No.2; (2) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体 系进行实时巧光PCR扩增； (3) 标准曲线绘制； (4) 通过标准曲线和待测样品的Ct值进行粪肠球菌的快速定量检测。
[0012] 作为优选，步骤(1)中所述粪肠球菌保守基因片段是通过W下引物扩增得到的： 上游引物为5 ' -CGTTGGACGACCCACAC-3 ' ； 下游引物为5 ' -CCACCGCAAGCATAAGA-3 ' ； 作为优选，PCR扩增所述粪肠球菌保守基因片段的条件为:94°C预变性5min; 94 °C 30s、 60°C 30s、72°C lmin，35个循环；72°C lOmin; 作为优选，步骤(2)中所述引物和探针的用量均为I.化I; 作为优选，步骤(2)中所述实时巧光PCR扩增的反应条件为:94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集巧光信号，40个循环。
[0013] 本发明的第五个目的是提供粪肠球菌的定性PCR检测方法，所述检测方法不W有 生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下： (1) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时巧光PCR扩增； (2) 通过待测样品的Ct值对粪肠球菌进行定性检测：当Ct值小于3別寸，为阳性;否则，为 阴性； 作为优选，步骤(1)中所述引物和探针的用量均为1.化1; 作为优选，步骤（1)中所述实时巧光PCR扩增的反应条件为:94°C预变性2分钟，94°C 15秒、60°C 40s并收集巧光信号，40个循环。
[0014] 本发明提供用于对粪肠球菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测 样品的RNA反转录得到的cDNA，也可W通过提取粪肠球菌的基因组DNA，结合实时巧光定量 PCR检测技术和所制备的标准品，可达到准确定量检测标本中粪肠球菌含量的目的。本发明 所提供的引物和探针可对临床感染的粪肠球菌含量进行定性、定量分析，对判断临床感染 粪肠球菌的含量具有重要意义，本发明将在临床检测领域发挥重要作用。
【附图说明】
[0015] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为引物和探针体系优化实验结果;其中，a代表引物为1.化1，探针为1.化l;b代表引 物为1.化1，探针为1.6]il; C代表引物为1.化1，探针为0.祉1; d代表引物为2.化1，探针为0.8 yl;e代表引物为l.化l，探针为0.祉l;f代表引物为2.化l，探针为1.0i^l;g代表引物为l.化 1，探针为0.祉1 ;h代表引物为1.化1，探针为1.化1; i代表引物为2.化1，探针为1.化1; 图2为灵敏度实验结果;其中，a代表质粒浓度为1.00 X 108copies/ml、b代表质粒浓度 为1.00 X l〇7copies/ml、c代表质粒浓度为1.00 X l〇6copies/ml、d代表质粒浓度为1.00 X l〇5copies/ml、e代表质粒浓度为 1.00 X l〇4copies/ml、f代表质粒浓度为 1.00 X l〇3copies/ ml、g代表质粒浓度为1.00 X 102copies/ml，h代表阴性对照； 图3为特异性实验结果;其中出现标准扩增曲线的为粪肠球菌质粒，未出现标准扩增曲 线的尿肠球菌、腐生葡萄球菌、化脈性链球菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、 流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、产气肠杆菌、乙型溶血性链球菌、福氏志贺氏菌、脑膜炎奈瑟 菌、阴性对照； 图4为粪肠球菌标准曲线。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述。W下的实施例便于更好地 理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。 [00 17] 实施例1 EF-16S基因标准品的制备 要建立实时巧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高 度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。16S RNA基因具有很高的保守性。本研究采用 粪肠球菌16S RNA基因作为祀序列。本实施例主要采用PCR技术扩增粪肠球菌16S RNA基因， 利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMDlS-T中，构建出重组质粒PMD18-T-EF-16S，并进 行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评 估奠定基础。
[001引一、模板DNA的制备 提取粪肠球菌(标准菌株)基因组DNA，用作16S RNA基因 PCR扩增的模板； (1) 取Iml粪肠球菌菌悬液，800化/min离屯、5分钟，弃上清液； (2) 加入10%薦糖的TE缓冲液40化1悬浮菌液沉淀，混匀后加入20mg/ml的溶菌酶， 37°C 作用 45min