草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明主要设及鉴定18个草木禪属物种的DNA条形码基因及其分类标准序列。具 体设及草木禪属18个物种植物条形码的开发和应用。
【背景技术】
[0002] 草木禪为豆科一年或两年生的草本异花授粉植物，其在全世界共有19种 (Stevenson ,1969)。草木禪属在花的结构，颜色，种子，叶片W及果芙形态上差异很大 化Iebesadel, 1954;Moussavi ,2001)，很难根据其形态特征和生活习性进行分类，并且在生 产流通中的品种混杂程度较高，不利于种质资源区分及入库分类保存。目前，对于草木禪属 不同物种的分类鉴定除了基本的形态研究外，没有更好的分类标准。因此，准确快速的鉴定 并区分草木禪属物种对其生产实践具有重要意义。
[0003] 目前，运用DNA条形码技术对植物的分类鉴定已有报道，并已形成了相关规范，但 该技术运用到草木禪的分类鉴定将面临一些困难，草木禪属物种为异花授粉植物，不同种 之间杂交，遗传差异小，单个条形码基因很难清晰鉴别不同种，标准的条形码序列很难确定 等。
[0004] 本发明采用DNA条形码技术，使用保守性好、特异性高的5个条形码基因，根据草木 禪条形码基因扩增的碱基序列不同进行鉴定。该鉴定方法具有高效、快速、准确等特点，尤 其是遗传差异较小的品种及一些种名混乱的地方品种，该方法具有更突出的区分能力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种草木禪属18个物种植物 条形码的目标条形码基因。
[0006] 本发明的目的二是提供一种草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因制 备方法。
[0007] 本发明的目的=是提供草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因标准分 类条形码序列。
[000引 W便高效、快速、准确的鉴定不同种草木禪。此方法操作简便，省时高效，可对未知 草木禪样本进行快速鉴定，相比传统的通过观察草木禪花、叶片、果芙等形态鉴定法，可大 大提高效率。该方法能在实验室条件下较短时间内很好的完成，具有很好的推广价值，有助 于种子检验人员快速有效的区分不同草木禪种质资源，有利于储存库草木禪种子准确的分 类保存。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种草木禪属18个物种植物条形码 的目标条形码基因，其主要特点在于包括有：
[0010] 草木禪属植物物种鉴定，基于ITS基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ): GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG;反向基因（5'-3'): RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA;
[0011] 或草木禪属植物物种鉴定，基于psbA-tr址基因的特异引物对，正向基因（5/-30: GTTATGCATGAACGTAATGCTC;反向基因（5'-3'): CGCGCATGGTGGATTCACAAATC;
[0012] 或草木禪属植物物种鉴定，基于rbcL基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ); AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT;反向基因（5'-3'): TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA;
[0013] 或草木禪属植物物种鉴定，基于matK基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ); CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC;反向基因（5' -3' ) :GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC;
[0014] 或草木禪属植物物种鉴定，基于tr化基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ); CGAAATCGGTAGACGCTACG;反向基因（5'-3'): ATTTGAACTGGTGACACGAG。
[0015] 所述的草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，其主要特点在 于包括有W下步骤：
[0016] A.通过草木禪的不同生物学特性初步鉴定18个种；
[0017] B.幼苗DNA的提取；
[001引 C.目标DNA条形码基因的筛选；
[0019] D.目标DNA条形码基因片段的扩增与测序；
[0020] E.测序结果的核查；
[0021] F.序列比对、编辑、质量核查、目标DNA条形码序列建树；
[0022] G.标准分类DNA条形码基因及对应序列的确认；
[0023] H.标准分类DNA条形码基因及对应序列准确性验证。
[0024] 所述的草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，其主要特点在 于所述的步骤F，包括基于ContigE邱ress的数据组织、编辑和分析法及ClustalW的多序列 比对法，基于最小进化原理的化i曲bor-化ining算法和no of difference(无差法)方法构 建聚类图。
[0025] 所述的草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，所述的步骤G 中所述的草木禪属18个物种植物标准分类DNA条形码基因对应序列是W下序列1到序列18 所示的DNA片段：
[00%] 序列1的名称为:M. wolgicus_Al_matK,序列为：
[0031] 序列3的名称为:M. a化us_A9_matK，序列为：
[0072] 本发明对草木禪各物种样本DNA条形码序列进行测序，使用口 S、psbA-trnH、rbcL、 matK、t;rnH作为草木禪物种鉴定的目标DNA条形码基因，基于ContigE邱ress的数据组织、编 辑和分析法及ClustalW的多序列比对法，基于最小进化原理的化ig化or-Joining算法和no Of difference(无差法)方法构建聚类图，形成一种鉴定草木禪属18个物种植物DNA条形码 技术的基本用法，确立标准分类条形码基因及对应序列，建立了一种快捷、高效、准确率高 的草木犀物种DNA条形码鉴定技术。
[0073] 本发明的有益效果是:首先，本发明从分子水平上开发了一种鉴定草木禪属18个 物种植物条形码技术，相较于传统的形态鉴定，该技术快捷，准确率更高;其次，确定了五种 不同的目标条形码基因：1了5、口364-化址[、1'13江、1]1日1:1(、化化，五者组合，在条形码数目、可靠 性、准确性上都大大优于常规的DNA条形码方法;再次，确定了标准分类条形码序列，能够快 速、有效、大批量的进行草木禪属不同种的鉴定，有利于草木禪种质资源的快速、准确分类 入库保存。
【附图说明】：
[0074] 图1为5种目标DNA条形码基因对应草木禪属不同物种PCR结果；
[0075] 图中：W草木禪属18个物种的部分种质DNA作为模板，1. WlTS特异引物进行PCR扩 增，得到一条65化P左右的单一、明亮电泳条带。2. W特异引物psbA-trnH进行PCR扩增，得到 一条40化P左右的单一、明亮电泳条带。3. W特异引物rb化进行PCR扩增，得到一条750bp左 右的单一、明亮电泳条带。4. W特异引物matK进行PCR扩增，得到一条7(K)bp左右的单一、明 亮电泳条带。5. W特异引物tmL进行PCR扩增，得到一条55化P左右的单一、明亮电泳条带。
[0076] 图2(a).条形码基因 psbA-tmH的测序峰图；
[0077] 图2(b).条形码基因 psbA-tmH的测序峰图；
[007引图2(c).条形码基因 psbA-tmH的测序峰图；
[0079] 图中:条形码基因的测序峰单一明显，基本无重叠峰，测序样本纯度高。
[0080] 图3(a)为.目标DNA条形码基因 ITS对应草木禪属18物种聚类图；
[0081 ] 图3(b)为.目标DNA条形码基因 psbA-trnH对应草木禪属18物种聚类图；
[0082] 图3(c)为.目标DNA条形码基因 rbcL对应草木禪属18物种聚类图；
[0083] 图3(d)为.目标DNA条形码基因 matK对应草木禪属18物种聚类图；
[0084] 图3(e)为.目标DNA条形码基因 tmL对应草木禪属18物种聚类图；
[0085] 图中：基于vectorNTI、clus化1W、MEGA6构建NJ亲缘关系树。
【具体实施方式】
[0086] W下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。下面对本发明的内容进行详细的说明。
[0087] 实施例1: 一种鉴定草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因，其主要特点 在于包括有：
[0088] 草木禪属植物物种鉴定，基于ITS基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ): GGAAGKARAAGTCGTAACAAGG;反向基因（5' -3' ) :RGTTTCTTTTCCTCCGCTTA。
[0089] 实施例2:-种鉴定草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因，其主要特点 在于包括有：
[0090] 草木禪属植物物种鉴定，基于psbA-trnH基因的特异引物对，正向基因（5/-30: GTTATGCATGAACGTAATGCTC;反向基因（5' -3' ) :CGCGCATGGTGGATTCACAAATC。
[0091] 实施例3:-种鉴定草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因，其主要特点 在于包括有：
[0092] 草木禪属植物物种鉴定，基于rbcL基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ); AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT;反向基因（5'-3'): TCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCA。
[0093] 实施例4:一种鉴定草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因，其主要特点 在于包括有：
[0094] 草木禪属植物物种鉴定，基于matK基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ); CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC;反向基因（5' -3' ) :GCTRTRATAATGAGAAAGATTCTGC。
[00M]实施例5:-种鉴定草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因，其主要特点 在于包括有：
[0096] 草木禪属植物物种鉴定，基于trnL基因的特异引物对，正向基因（5/-3/ ); CGAAATCGGTAGACGCTACG;反向基因（5'-3'): ATTTGAACTGGTGACACGAG。
[0097] 实施例6:草木禪属18个物种植物条形码的目标条形码基因制备方法，包括有W下 步骤：
[0098] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得 到的。
[0099] A.通过草木禪的不同生物学特性初步鉴定18个种；
[0100] 从国内外多地收集草木禪材料，根据草木禪不同种花的结构，花的颜色，种子，叶 片W及果芙特性初步判定各草木禪所属、种。
[0101] B.幼苗DNA的提取；
[0102] 草木禪种子发芽:分别取18个种不同种质草木禪种子20粒，砂纸打磨破硬实后放 在铺有湿润滤纸的培养皿中，将培养皿置于24°C培养箱中，白天16h，黑夜化培养一周，并定 期更换滤纸。幼苗DNA的提取:使