一种用于坡月坚螺线粒体基因组测序和检测鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学检测鉴定领域，具体设及一种用于坡月坚螺Camaena poyuensis线粒体基因组测序和检测鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 坡月坚螺Camaena poyuensis是近年来新发现的一种重要有害生物，在分类上属 于软体动物口Mo 1 Iusca，腹足纲Gas tropoda，柄眼目Sty Iommatophora，坚齿螺科 Camaenidae，坚螺属Camaena。该螺不但严重危害农林生产，而且传播人畜共患寄生虫病，对 人畜健康威胁极大。迄今为止，中国坚螺属Camaena左旋类群只发现2个种，即坡月坚螺和皱 瘤坚螺C. cicatricosa，两者在形态上较为相似，鉴定困难，尤其是坡月坚螺与皱瘤坚螺种 下亚种的形态特征极为相似，更是难W鉴别，只有资深的陆生软体动物分类专家通过解剖 才能鉴别，卵粒和幼螺则分类专家也无法准确鉴定。
[0003] 由于历史的原因，目前我国植物保护专业和医疗卫生专业均没有开设陆生软体动 物相关课程，对陆生软体动物的分类鉴定知之甚少，运种局面给我国的实际防治工作造成 了被动，也是世界各国有关部口共同面临的技术难题。近年来，分子系统学飞速发展，即由 基因序列的比较可W厘清物种的分类学与系统学地位。而PCR技术在我国农业和卫生部口 已经普及，如果能设计出特异性引物用PCR扩增方法进行测序和检测鉴定，运个难题就迎刃 而解。本发明旨在建立一种PCR方法扩增定序坡月坚螺线粒体基因组和检测鉴定新技术，W 适应当前实际工作的需要。
【发明内容】
[0004] 本发明针对传统形态学鉴定技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种准确性 好、灵敏度高、成本低廉的测序和鉴定方法，应用于坡月坚螺的检测鉴定。
[000引本发明提供了一种用于坡月坚螺线粒体基因组测序和检测鉴定方法，所述方法是 应用通用引物和特异性引物对坡月坚螺的分子特征进行测序和识别，所述4对特异性引物 为：
[0006] 其中（1)和(2)用于扩增<2化的短片段，（3)和(4)用于扩增〉4化的长片段。
[0007] 本发明的PCR反应体系和程序如下： 短片段扩增：PCR扩增体系总体积为25化，其中含Mg2+的IOXPCR buffer 2.扣L， 2.5mM each dNTP MixUire 2化，IOiiM上下游引物各化L，抓/化的I^KaRa hq DNA酶0.化 L，lOOng/化的DNA模板化L，d地2〇 1化1^;反应程序为：94°C预变性30s，94°C变性IOs，50°C 复性50s，72°C延伸lmin，40个循环之后72°C延伸10min;4°C终止。
[000引长片段扩增:PCR扩增体系总体积为25化，其中不含Mg2+的IOXLA PCR buffed.5 化，25mM的MgCl2 2.5化，2.5mMeachdNTPMix化re4化，10i^M上下游引物各化L，抓A^L 的 TaKaRa LA Taq酶0.2化LaOOng/iiL的DNA模板化1，(1地2012.7化1^;反应程序为：94°(：预 变性 lmin，98°C 变性 103,60°(：复性303,68°(：延伸5~8111111，40个循环^后72°(：延伸6111111，41： 终止。
[0009] 通过双向测序、碱基校对、序列拼接和比对分析，测通的坡月坚螺线粒体基因组全 长13，798bp，包括13个蛋白编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因。
[0010] 本发明的显著优点：本发明既测通了坡月坚螺的线粒体全基因组，又可用于该螺 的快速、准确比对鉴定。本发明为农业和卫生部口准确检测鉴定坡月坚螺提供了新的技术 手段，对于防止坡月坚螺的危害和扩散及传播人畜共患寄生虫病具有重要意义。本发明具 有W下有益效果： 1、结果可靠:本发明所测通的坡月坚螺线粒体全基因组，为该螺的分子比对鉴定提供 了可靠的基础。W往技术分子比对鉴定常用的是某一基因的一个片段，由于信息量有限，其 可靠性易受质疑。本发明采用线粒体全基因组或多个基因片段进行比对，因此结果的可靠 性具有充分的保证。
[0011] 2、特异性强:所采用的引物是针对坡月坚螺的线粒体全基因组序列设计出的特异 性引物，特异性高。
[001引3、灵敏度高:对坡月坚螺的检测灵敏度在DNA7JC平上可达到1 pg/化。
[0013] 4、实用性好：当传统分类学方法难W鉴定坡月坚螺时，本发明方法用分子生物学 技术进行弥补，从而得到快速、准确、灵敏度高的检测鉴定坡月坚螺的PCR方法。因此本方法 的实用性强，可满足对坡月坚螺进行快速可靠检测和鉴定的实际需要。
【附图说明】
[0014]图1坡月坚螺线粒体基因组图谱。其中：tRNA缩写根据IUPAC-IUB所用符号；带横 线的基因表示翻译方向3'-5'，不带横线的基因表示翻译方向5'-3'；圈内圆线表示引物扩 增区域，数字表示所用引物编号。
【具体实施方式】
[001引实施例1:坡月坚螺PCR扩增测序试验 1、材料的准备 试验材料取自广西壮族自治区河池市己马县坡月镇。将采集到的活体标本用水闷杀12 ~24小时，泡浸于无水乙醇中，保存在-20°C冰箱中备用。
[0016] 2、基因组DNA提取 挑选保存完好的蜗牛标本，取其腹足肌肉约〇.〇5g，用W提取DNA。先将剪下的组织置 于无菌双蒸水浸泡3~6小时，去除残余酒精，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/ 细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离屯、柱型）提取坡月坚螺的总基因组DNA，抽提完毕后利 用凝胶电泳检测法对提取的DNA浓度进行检测，合格样品保存于-20°C冰箱备用。
[0017] 3、引物设计及PCR扩增 先用4对目前已发表的线粒体基因组片段通用引物进行首轮扩增。根据已扩增出的短 片段序列，在Primer Premier 5和Oligo 6的辅助下，经反复测试和优化，设计出本发明的4 对特异性引物（表1)，其中（1)和（2)用于扩增短片段（<2kb)，（3)和（4)用于扩增长片段（〉 地b)。
[001引表1坡月坚螺线粒体基因组PCR扩增引物
短片段扩增：PCR扩增体系总体积为25化，其中含Mg2+的10 X PCR buff er 2 .扣L， 2.5mM each dNTP MixUire 2化，IOiiM上下游引物各化L，抓/化的I^KaRa hq DNA酶0.化 L，lOOng/化的DNA模板化L，d地20 反应程序为：94°C预变性30s，94°C变性IOs，50°C 复性50s，72°C延伸lmin，40个循环之后72°C延伸10min;4°C终止。
[0019] 长片段扩增:PCR扩增体系总体积为25化，其中不含Mg2+的IOXLA PCR buffed.5 化，25mM的MgCl2 2.5化，2.5mMeachdNTPMix化re4化，10i^M上下游引物各化L，抓A^L 的TaKaRa LA Taq酶0.2化LaOOng/化的DNA模板化L，d地2〇12.7化1^;反应程序为：94°(：预 变性1111111，98°(：变性1〇3,60°(：复性3〇3,68°(：延伸5~8111111，40个循环^后72°(：延伸6111111，4 °C终止。
[0020] 用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。短片段PCR扩增产