Cyp4f2基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种CYP4F2基因的检测引物组、其构成 的反应体系及应用。
【背景技术】
[0002] 华法林，是一种香豆素类抗凝剂，作为临床应用最为广泛的抗凝药物之一，具有价 格低廉，小剂量即可起效等优点，主要用于防治静动脉血栓栓塞性疾病，适用患者人群为屯、 脏瓣膜置换、房颤、深静脉血栓和肺栓塞患者。但是，目前在临床上，华法林的用药面临一个 严重的问题，即华法林的给药剂量非常难W掌握，剂量不足会导致体内血栓的产生，而剂量 稍大则会加大出血的倾向。
[0003] 目前，国内外临床工作者们多采用定期监测国际标准化比值（INR)和凝血酶原时 间（PT)两种手段监测华法林的临床药效。而近年来，对于华法林药效学影响因素的研究热 点则主要集中在遗传药物基因组学方面运个研究领域。由于华法林的抗凝作用主要由S-华 法林产生，而S-华法林的体内代谢主要是由细胞色素 P450酶超家族中的CYP2C9完成CYP2C9 可W催化人体内的华法林成为无活性形式6-或7-径基华法林，所WCYP2C9的活性对华法林 的抗凝治疗效果有着十分重要的影响。除此之外，另外一种等位基因 CYP4F2的遗传多态性 与华法林剂量也有不可忽视的关联。CYP4F2*3(rs2108622C〉T，V433M)可导致细胞色素药物 酶活性降低，相反患者体内维生素 K的浓度会增高。所W携带运种突变型等位基因的患者在 使用华法林时，体内出血风险与野生型等位基因携带者相比会大大增高。因此，临床上在使 用华法林进行治疗的过程中，对于CYP4F2*3突变型等位基因的检测，会给华法林的安全使 用带来更可靠的保障。
[0004] 目前，临床及市场上针对CYP4F2的突变型等位基因检测已经有了商品化的试剂 盒，运些试剂盒所采用的技术主要包括化qman-MGB巧光探针法、液相忍片法、一代测序法、 二代测序法。CN 104561302A公开了一种CYP4F2基因多态性的检测探针，所述检测探针的核 巧酸序列选自序列1和序列2,5'和3'端分别具有巧光基团和泽灭基团，并且巧光基团所发 巧光的波长峰值在不同的位置。运些技术手段均在不同方面展现出了自己的优势，但是也 都普遍存在检测仪器及配套试剂耗材购买成本高昂，检测需要复杂的变溫循环过程，周期 长、操作繁琐且假阳性率时有出现的问题。因此，发明并构建一套价格低廉，使用操作简便 且利于临床检验大范围普及的商品化试剂盒就显得十分重要。
[0005] 环介导的等溫扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等溫扩增技术， 其主要特点是针对祀基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下进行恒溫扩增，仅需15-90分钟即可产生IO9-IOW数量级的产物。具有 敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。
【发明内容】
[0006] 本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种CYP4F2基因的检测引物组、其构成的 反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0007]为达到此发明的目的，本发明采用W下技术方案：
[000引第一方面，本发明提供一种CYP4F2基因的检测引物组，所述检测引物组如下：
[0009] 正向外侧引物F3:
[0010] 反向外侧引物B3:
[00川正向内侧引物Fn G;
[001 ^ 反向内侧引物Bn T；
[oou] 反向内侧引物Bn T。
[0014] 优选地，所述SEQ ID NO: 1-4所示的序列是用于检测rs2108622位点的C等位基因。
[0015] 优选地，所述沈Q ID NO: 1-3和沈Q ID NO: 5所示的序列是用于检测rs2108622位 点的T等位基因。
[0016] 本发明中，外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3,内侧引物记为正向 内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了Flc和F2，BIP包含了Blc和B2,上述引物均 由在线软件PrimerE邱Iorer V4设计。本发明在普通LAMP的基础上，W特异性要求最严格的 Blc的5'端针对rs2108622位点设计等位基因特异引物，分别检测rs2108622的C等位基因和 rs2108622的T等位基因。通过分别在BIPC和BIPT的5'端第S位引进额外突变，进一步降低 非特异性扩增的可能性。
[0017] 第二方面，本发明提供一种检测CYP4F2基因的反应体系，所述反应体系包括第一 方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，径基糞酪蓝，甜菜碱，Bst DNA聚合酶，待检样品基 因组DNA和去离子水。
[001引优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S04，MgS04和Tween-20。
[0019]优选地，所述Tr i S-HCI 的浓度为 10-30mM，例如可 W 是 IOmM、I ImM、12mM、13mM、 151111、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，优选为15-251111，进一步优选为 2 OmM O
[0020] 优选地，所述 KCl 的浓度为 10-60mM，例如可 W 是 10mM、llmM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、2 日mM、30mM、3 日mM、40mM、4 日1111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、5日1111或6〇1111，优选为 50-55mM，进一步优选为50mM。
[0021] 优选地，所述(NH4)2S04 的浓度为 5-13mM，例如可 W 是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、 "mM、12mM或13mM，优选为8-12mM，进一步优选为1 OmM。
[0022] 优选地，所述 MgS〇4 的浓度为 2-8mM，例如可 W 是 2111]\1、31111、41111、5111]\1、6111]\1、71111或81111， 优选为2-6mM，进一步优选为4mM。
[0023] 优选地，所述Tween-20的体积分数为0.1-1 %，例如可W是0 .!%、0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%，优选为0.1%。
[0024] 优选地，所述dNTPs的浓度为 1 -2mM，例如可 W是 ImM、1. ImM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，优选为1.2-1.8mM，进一步优选为1.4mM。
[00巧]优选地，所述径基糞酪蓝的浓度为108-130咖，例如可W是10如M、10化 111山1、112山1、115山1、116山1、11祉]?、120山1、122山1、125山1、126山1、12祉]\1或130山1，优选为115-123iiM，进一步优选为120iiM。
[00%] 优选地，所述甜菜碱的浓度为0.1-lM，例如可W是0.謹、0.21、0.4]?、0.61、0.81或 IM，优选为0.5-0.8M，进一步优选为0.8M。
[0027]作为优选技术方案，所述反应体系包括反应体系C和反应体系T，其中每个25iiL反 应体系含有W下组分：
[002引缓冲液： Tris-HCl mM KCl 5 0 mM 巧 H4)2S04 10 mM MgS04 4 mM Tween-20 0 1% (体积分数) 做TPs 1.4 mM 径基蔡酷蓝 120 pM
[0029] 敌菜碱 0.8 M 巧 々.4 JiM B3 0.4 卿 FIP 1.6 MM BIPC/BIPT 1.6 IiM Bst DNA聚合酶 8 U 待检测样品基因组 0满-4 ng/|正 去离子水加至25叫L。
[0030] 第=方面，本发明提供一种如第二方面所述的反应体系的使用方法，所述方法包 括如下步骤：
[0031] 将反应体系C和反应体系T所需各组分混合完毕，放置于恒溫水浴锅进行反应，反 应后升溫进行灭活处理，再根据体系颜色变化判定结果。
[0032] 优选地，所述恒溫水浴锅的溫度为55-70C，例如可W是55r、56r、57r、58r、59 °C、60°C、6rc、62°C、63°C、64°C、65°C、68°C、69°C或70°C，优选为60-68°C，进一步优选为65 〇c。
[0033] 优选地，所述反应时间为15-90min，例如可W是15min、20min、25min、30min、 35min、40min、45min、SOmin、55min、60min、65min、TOmin、75min、SOmin、85min 或 90min，优选 为45-90min，进一步优选为70min。
[0034] 优选地，所述升溫后的溫度为78-90°C，例如可W是78°C、79°C、80°C、8rC、82°C、 83°(：、84°(：、85°(：、86°(：、87°(：、88°(：、89°(：或90°(：，优选为80-85°(：，进一步优选为80°(：。
[0035] 优选地，所述升溫后的反应时间为15-30min，例如可W是15min、16min、17min、 18min、19111；[]1、2〇111；[]1、22111；[]1、25111；[]1、26111；[]1、28111；[]1或3〇111；[]1，优选为18-26111；[]1，进一步优选为 20min。
[0036] 优选地，所述根据体系颜色变化判定结果为：
[0037] 反应体系C为紫罗兰，反应体系T为天蓝色，则待测位点基因型为TT;
[0038] 反应体系C为天蓝色，反应体系T为紫罗兰，则待测位点基因型为CC;
[0039] 反应体系C为天蓝色，反应体系T为天蓝色，则待测位点基因型为CT。
[0040] 第四方面，本发明提供一种检测CPY4F2基因的检测试剂盒，所述试剂盒包含如第 二方面所述的反应体系。
[0041] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：