酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及谷胱甘肽的制备方法，特别涉及一种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法。
【背景技术】
[0002]谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。
[0003]GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。
[0004]目前谷胱甘肽的主要制备方法有:溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已较少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。目前国内外GSH生产基本采用发酵法，原理是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低，且过多的副产物使下游工艺处理复杂。
[0005]近年来酶法生产GSH技术逐步提高，使大规模生产变为可能。经典的酶法生产GSH依赖于γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II)两种酶，Gsh I催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ -谷氨酰半胱氨酸，Gsh II催化γ -谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成过程中，由于Gsh I催化过程受到终产物GSH的反馈抑制，因此使生成γ -谷氨酰半胱氨酸的第一步反应成为整个GSH合成的限速步骤。
[0006]随着进一步研究，人们在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等十几种细菌中都发现了一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF酶)。该酶同时具有Gsh I与Gsh II的活性，可一步催化GSH合成，且该酶反馈抑制作用较小，非常适和应用于酶法合成谷胱甘肽。
[0007]酶法合成GSH的最大问题是三磷酸腺苷(ATP)的大量消耗，生产Ikg GSH至少需使用3-5kg的ATP，成本过高。为了解决这方面的问题，可使用酵母糖酵解再生ATP的方法与之偶联，专利CN201210201691.2中使用该方法再生ATP，效果稳定。但使用酵母会在反应体系中引入色素等杂质，给进一步纯化增加难度，使用酶系再生ATP是近年来的研究方向。此外，专利CN201510762184.X中使用多聚磷酸盐酶系再生ATP，取得了很好的效果。该酶系包含多聚磷酸盐激酶(Ppk)、腺苷酸激酶(Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸转移酶(Pap)。其中，Ppk与Pap酶在反应过程需添加多聚磷酸盐，对GSH反应转化率、能达到的最大浓度及后期纯化均有影响。因此，如何使用Adk酶优化GSH的生产，降低ATP的使用量，且在保证产物GSH易于纯化及分离的基础上，能同时制备得到其它有经济效益的产物，如腺苷酸(AMP)，成为目前的研究重点。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种酶法同时制备谷胱甘肽(GSH)和腺苷酸(AMP)的方法，从而克服现有技术的上述缺陷。
[0009]本发明是通过以下技术方案来实现的:
[0010]—种酶法同时制备谷胱甘肽和腺苷酸的方法，该方法包括以下步骤:
[0011](I)利用GshF酶和Adk酶在反应罐中生成GSH和AMP:
[0012]在反应体系中添加ATP、GshF酶和Adk酶，反应生成GSH和AMP，其中所述反应体系为含有底物ATP、谷氨酸(Glu)或其盐、半胱氨酸(Cys)或其盐、甘氨酸(Gly)或其盐、以及镁离子和锰离子的一种或两种的水溶液。另外，反应体系中还可包含钾离子、钠离子、铵离子和Tris和磷酸根离子的一种或几种。本发明添加的底物、酶及各类盐可一次性加入反应体系，也可按照工业生产工艺流程分批次流加补入。
[0013](2)分离 GshF 酶和 Adk 酶:
[0014]固定化的GshF酶和Adk酶在反应罐中直接分离。上述分离可通过滤袋分离，也可在反应柱中直接分离。
[0015]游离的GshF酶和Adk酶通过滤器中超滤膜分离。其中，过滤器具有进料口、出料口和回流口，内设截留分子量小于20kDa的超滤膜。经过滤器的截留液为回收的酶液，滤出液为分离出酶之后的反应液;以及
[0016](3)分离产物 GSH 及 AMP:
[0017]通过离子交换法，从上述步骤(2)的滤出液中分离产物GSH，经离子交换后的穿出液中主要含有另一产物AMP。
[0018]优选地，上述技术方案中，还包括以下步骤:
[0019](4)步骤(2)中分离的GshF酶和Adk酶的循环利用:
[0020]即将分离的GshF酶和Adk酶添加至反应罐中生成GSH和AMP及再生ATP的连续反应。
[0021](5)GshF酶和Adk酶的连续分离:
[0022]即连续分离固定化的GshF酶和Adk酶或使用过滤设备连续分离游离的GshF酶和Adk 酶 ο
[0023]优选地，上述技术方案中，还包括以下步骤:
[0024](6)产物GSH的连续分离。反应生成的GSH通过过滤或离子交换方法分离。
[0025](7)产物AMP的连续分离。反应生成的AMP通过过滤或离子交换方法分离。
[0026]优选地，本发明的上述技术方案中，步骤(I)至步骤(3)可以重复至少一次。优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。
[0027]优选地，上述技术方案中，步骤(I)在反应罐中生成GSH和AMP的反应条件如下:
[0028]反应温度为25-55 Γ，优选温度为30-50 °C ；
[0029]反应pH 为 5-10，优选 pH 为 6-9。
[0030]优选地，上述技术方案中，GshF酶、Adk酶为游离或者固定化的酶和/或再生酶，按反应最优条件计算，两种酶添加质量比例优选为GshF: Adk= (0.2-30):1，更优选为(0.5-20):1 AshF酶添加浓度优选为0.002-lg/L。上述的GshF酶、Adk酶可来源于任何生物，或者是经过人工改造具有同样催化功能的酶。
[0031 ]优选地，上述技术方案中，氨基酸或其盐均为L型氨基酸或其盐。按其经济成本及反应最优条件计算，三种氨基酸添加质量比例优选为Glu: Cys: Gly= (1-2.5):1:(0.5-1.5)，更优选为Glu:Cys:Gly = (l.2-2):1:(0.8-1.5)。半胱氨酸添加浓度优选为I _50g/L。
[0032]优选地，上述技术方案中，本发明添加的ATP浓度为1-150g/L;镁离子浓度为0.01-0.1M;锰离子浓度为0.01-0.1M;钾离子浓度为0.01-0.3M;钠离子浓度为0.01-0.3M;铵离子浓度为0.005-0.2M; Tris浓度为l-12g/L、磷酸盐浓度为l-15g/L。
[0033]优选地，上述技术方案中，镁离子选自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁和硝酸镁中的一种或多种;锰离子选自于氯化锰和硫酸锰中的一种或多种；钾离子选自于氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、亚硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的一种或多种;钠离子选自于氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的一种或多种;铵离子选自于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、氨水、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的一种或多种。
[0034]优选地，上述技术方案中，步骤(2)中固定化酶通过下列方式固定于固定化载体:吸附、交联、共价结合、包埋或其组合。GshF和Adk两种酶可分别固定或按比例混合后一起固定。固定化载体选自于高分子载体、无机载体和磁性高分子微球载体的一种或多种。
[0035]其中，高分子载体选自于纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明胶、卡拉胶、尼龙和合成高聚物的一种或多种组合;无机载体选自多孔玻璃、氧化娃、活性炭、娃胶和娃藻土的一种或多种组合。当进行酶促反应时，可将固定化酶分散在反应液中直接进行反应，反应结束后通过过滤方式回收酶;或者将固定化酶装填入反应柱中，按一定流速将反应液栗入通过柱体进行酶促反应。
[0036]优选地，上述技术方案中，本发明方法步骤(2)中采用的超滤膜选自于醋酸纤维素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。
[0037]与现有技术相比，本发明技术具有以下有益效果:
[0038]I)优化了GSH生产的反应条件，可以大大提高底物浓度，使GSH生成浓度达到30-50g/L，其中，当GSH生成量达30-40g/L时，氨基酸利用率可达到75-90 %。且该方法由于初始底物浓度高，反应速率快，节省了反应时间；
[0039]2)使用Adk酶能够对反应中消耗的ATP进行部分再生。单独使用GshF酶生产GSH时，生产Ikg GSH至少需使用3-5kg的ATP，添加Adk酶后，生产Ikg的GSH需要约1.5-2.5kg的ATP，大大降低了ATP的消耗量;另外，再生反应不需添加如多聚磷酸盐之类的其它底物，不影响GshF酶催化的生成GSH的酶促反应，保证GSH的生成量及反应速率；
[0040]3)经Adk酶催化后，反应体系中仅极少量ADP剩余，95 %以上的ADP—部分转化为ATP继续使用，降低了 ATP的消耗量，另一部分生成大量AMP JMP与GSH在纯化过程中易于分离，纯化过程简单，可作为另一产物在制备GSH过程中同时制备。通过市场价格以及成本分析，此方法经济实用；
[0041 ] 4)建立了适合GshF酶和Adk酶的稳定回收体系，无论固定化还是游离的GshF酶和Adk酶组合都可以应用于大规模连续生产；
[0042]5)本制备