可分泌抗突变b型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及B型肝炎病毒抗体及免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗突变B型 肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] B型肝炎病毒(HBV)是具有脂质双层膜的外鞘、作为蛋白质的核壳、DNA聚合酶和基 因组DNA的嗜肝DNA病毒科的双链DNA病毒。位于B型肝炎病毒（HBV)S蛋白质的表面抗原 (HBsAg)与病毒的感染有关。HBV等病毒进化速度迅速，基因组发生突变的概率高。如果 HBsAg的结构变化，以往用于HBV诊断的抗HBs抗体就不能与HBsAg结合，有时会将HBV感染者 诊断为HBV阴性。因此在HBV的检查中，重要的是要使用既可以与野生型的HBsAg结合，又可 以与突变型HBsAg结合的抗体。
【发明内容】
[0003] 基于此，有必要提供一种可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细 胞，该可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体及应用。 这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg结合。
[0004] -种可分泌抗B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2015224〇
[0005] 在一个实施例中，所述单克隆抗体为由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗B型 肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
[0006] 在一个实施例中，所述单克隆抗体可识别野生型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg和突 变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg。
[0007] 在一个实施例中，所述单克隆抗体可识别多个突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg 的"a"抗原决定基。
[0008] 在一个实施例中，所述单克隆抗体可识别突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的 "a"抗原决定基的一个突变。
[0009] 在一个实施例中，所述突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg为sAg突变。
[0010] 在一个实施例中，所述sAg突变的突变序列为G145R、T131N、A159V、S143M、F158S、 F161S、L134R或T123I。
[0011] 在一个实施例中，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。
[0012] 上述的单克隆抗体在制备B型肝炎检测试剂领域或制备B型肝炎检测设备领域的 应用。
[0013] -种B型肝炎检测试纸，包括上述的单克隆抗体以及与所述单克隆抗体结合的固 相载体。
[0014] 这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg结合，从而 在HBV的检查中，提高了检查的阳性率，避免了由于HBV病毒基因组发生突变而导致的假阴 性。
【附图说明】
[0015]图1为实施例1中单克隆抗体检测HBsAg的效价图。
[0016] 图2为实施例1中单克隆抗体检测亲和力的鉴定图。
【具体实施方式】
[0017] 下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗 体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
[0018] -实施方式的可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞于 2015年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保 藏号为CCTCC N〇:C2015224,分类命名：杂交瘤细胞株12E6。
[0019] 这种杂交瘤细胞的分泌产量高，其分泌得到的单克隆抗体能够针对性的识别B型 肝炎病毒表面抗原，并且具有高亲和力、高特异性、不仅能识别野生型HBsAg，也可以识别 突变型HBsAg等优点，可广泛应用在B型肝炎病毒表面抗原检测领域，如检测试剂或检测设 备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的单克隆抗体具有显著的优 势。
[0020] -实施方式的单克隆抗体，为上述可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗 体的杂交瘤细胞分泌的抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
[0021] 这种单克隆抗体可识别野生型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg和突变型B型肝炎病毒 表面抗原HBsAg。
[0022] 优选的，这种单克隆抗体可识别多个突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的"a"抗 原决定基。
[0023]优选的，这种单克隆抗体可识别突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg的"a"抗原决 定基的一个突变。
[0024]更优选的，突变型B型肝炎病毒表面抗原HBsAg为sAg突变。
[0025] 特别的，sAg 突变的突变序列为 G145R、T131N、A159V、S143M、F158S、F161S、L134RS T123I〇
[0026] 这种单克隆抗体可以为鼠源单克隆抗体。
[0027] 这种单克隆抗体既可以与野生型的HBsAg结合，又可以与突变型HBsAg结合，从而 在HBV的检查中，提高了检查的阳性率，避免了由于HBV病毒基因组发生突变而导致的假阴 性。
[0028] 这种单克隆抗体可以用于制备B型肝炎检测试剂领域或制备B型肝炎检测设备领 域。
[0029] 具体的，一实施方式的B型肝炎检测试纸，包括上述单克隆抗体以及与上述单克隆 抗体结合的固相载体。
[0030] 固相载体可以为磁性微球、乳胶微球、聚苯乙烯板或硝酸纤维素膜。
[0031] 单克隆抗体与固相载体结合后，通过加入另一个或多个抗体或者免疫活性片段的 标记物形成抗原抗体复合物，测定值的高低在一定量抗体存在时与样品中的B型肝炎病毒 表面抗原成正比。通过特定仪器的测定值，参照校准曲线即可计算出待测样品中B型肝炎病 毒表面抗原的含量。
[0032] 此外，单克隆抗体还可以直接或间接结合固相载体后作为包被抗体，通过另一个 或多个抗体或者免疫活性片段的标记物(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、叮啶酯、荧光物质、 胶体金等)用于其他形式的B型肝炎病毒表面抗原检测试剂或设备中。
[0033] 通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，在提 高灵敏度的同时改善特异性。通过使用上述抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，制备 得到的试剂盒与现有B型肝炎检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度及检出率方面都具有显著 的优势。
[0034] 下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗 体的杂交瘤细胞分泌、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
[0035] 实施例1
[0036] 杂交瘤细胞株的建立与抗突变B型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的制备
[0037] 1.抗原免疫
[0038]将等量重组B型肝炎病毒表面抗原（深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)与弗氏完全佐剂（外观：琥珀色细胞悬浮液；组份：Paraffin Oil 85%， Mannide Monooleate 15%，Mycobacterium smegmatis lmg/mL)混合，得到油状乳液。将该 乳液以0.2mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠（广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只）背部位 点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(等量抗原与弗氏不完全佐剂混合），增强免疫到四针 后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。
[0039] 融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
[0040] 2.杂交瘤细胞株的制备
[0041] (1)饲养细胞的制备
[0042]以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75 %酒 精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入 RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，lOOOrpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中）重悬，调整细胞浓度1 X 105个/mL，加入 96孔板，150yL/孔，37 °C，5 % C02培养过夜。
[0043] (2)免疫脾细胞的制备
[0044] 小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养 液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基 础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。
[0045] (3)骨髓瘤细胞的制备
[0046]小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细 胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计 数。
[0047] (4)细胞融合及HAT选择杂交瘤
[0048] 将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640 基础培养液洗1次，1200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入lmL50%的PEG1500 融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。lOOOrpm，离心5分钟。 弃上清，用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，50yL/孔，37°C，5 % C02培养。培养至第六天，换HAT培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液)两次。
[0049] (5)抗体的检测
[0050]用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释天然HBsAg，使其终浓度为2yg/mL。每孔0. lmL， 加入96孔聚苯乙烯板，37°C2小时或4°C过夜。次日，用含10%小牛血清或1 %脱脂奶粉的 0.02M pH7.2PBS，0.15mL/孔，37°C封闭2小时，用于检测。融合后第七天，取细胞上清0. lmL 于上述96孔检测板中，37Γ30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊 抗鼠 IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-M