一种药物性耳聋的检测引物组、其构成的反应体系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种药物性耳聋的检测引物组、其构成 的反应体系及应用。
【背景技术】
[0002] 药物中毒性耳聋(简称药物性耳聋），是指患者因使用或接触某些耳毒性药物而造 成的耳聋，运些药物(包括氨基糖巧类抗菌素、非氨基糖巧类抗菌素、水杨酸盐等)均对人类 听觉神经具有毒副作用，可破坏耳蜗，一般造成双侧、永久性耳聋，多不可逆。
[0003] 根据中国2006年第二次全国残疾人抽样调查结果显示，听力残疾患者人数约2004 万人，占全国8296万残疾人总数的24.16%，其中药物致聋的人数多达800万。其中，氨基糖 巧类抗生素的不恰当使用是造成药物性耳聋发生的最常见因素，运类抗生素包括常见的链 霉素、庆大霉素等。另外有研究结果表明，人类线粒体基因突变的发生与药物性耳聋密切相 关。在中国人群中，线粒体基因的A1555G、C1494T运两个位点突变的发生频率高达4%。 A1555G突变和C1494T突变会在12S rRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U- A1555碱基对。运些改变使得12S rRNA在二级结构上与细菌的leSrRNA的相应区域的二级结 构更加相似，导致糖巧类药物与之发生"不应该"的结合，引起细胞膜上的化+，K+-ATP累功 能障碍，造成毛细胞损伤，导致药物性听力受损甚至耳聋。
[0004] 目前用于检测运两个位点突变的方法有很多种，如Sanger测序法，运种方法可W 很直观得得到目的位点的突变情况，然而操作复杂，需要两次PCR和大量的纯化工作，并且 费用高昂，耗时较长，不适合大范围推广使用;等位基因特异性PCR法，运种方法通过设计突 变型和野生型特异的PCR引物，通过电泳比较野生型和突变型PCR产物的大小不同W判定检 测样本的突变状况，优点是费用低廉，然而大规模检测时样本量较大，同时进行大量的电泳 操作就会变得非常繁琐，而且容易造成交叉污染;巧光定量PCR法灵敏度高，不需要人工检 巧。，因此目前应用比较广泛，然而它依然不能摆脱对昂贵的设备的依赖，同时，用于检测的 探针也是一笔不小的支出。因此，非常有必要开发一种既能快速准确又能价格低廉的检测 方法。
[0005] 环介导的等溫扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等溫扩增技术， 其主要特点是针对祀基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)的作用下进行恒溫扩增，仅需15-90分钟即可产生109-l〇w数量级的产物。LAMP 反应对模板DNA的质量要求远没有PCR反应严格，因此DM的粗提物就可W直接作为检测模 板，比起WPCR为基础的检测方法具有更大的优势，可免去DNA提取的成本和繁琐操作的步 骤，尤其是在大量样本的检测中，运种优势就更加明显。同PCR反应一样，LAMP的反应也需要 引物3端与模板的严格配对，具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定 的优点。
【发明内容】
[0006] 本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种药物性耳聋的检测引物组、其构成的 反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。
[0007] 为达到此发明的目的，本发明采用W下技术方案：
[0008] 第一方面，本发明提供一种药物性耳聋的检测引物组，其特征在于，所述检测引物 组如下：
[0009] 正向外侧引物F3C:沈Q ID N0:1:GGCAAGAAATGGGCTACA;
[0010] 反向外侧引物B3C:沈Q ID N0:2:CGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTC;
[00川正向内侧引物FIPC:SEQ id N ο : 3 : TGCTAAATCCACCTTCGACCTCTACCCCAGAAAACTACGAT；
[0012] 反向内侧引物 BIPC:SEQ id N ο : 4 ： TAAGAGTAGAGTGCTTAGTTGAACACTTTGAAGTATACTTGAGGATG；
[0013] 正向外侧引物F3T:沈Q ID N0:5:AAACTTAAGGGTCGAAGGTGG;
[0014] 反向外侧引物B3T:沈Q ID N0:6:CTGGTTCGTCCAAGTGCA;
[001引正向内侦J引物FIPT:SEQ ID N Ο : 7 ： AGGGACGGGCGGTGTGTACGAGCAGTAAACTAAGAGTAGAGTGC;
[0016] 反向内侦J 引 物 BIPT:SEQ id N ο : 8 ： AGGACATTTAACTAAAACCCCTACGCATCCAGTACACTTACCATGTTACG；
[0017] 正向外侧引物F3A:沈Q ID N0:9:CGAAGGTGGATTTAGCAGTA;
[001 引反向外侧引物B3A:沈Q ID N0:10:CCTAAGTGTAAGTTGGGTGC;
[0019] 正向内侦J 引 物 FIPA:SEQ ID N Ο : 1 1 ： TGTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGGGAGTAGAGTGCTTAGTTGAAC;
[0020] 反向内侦J 引 物 BIPA:SEQ ID N 0 : 1 2 ： ACCAGTCGTAACATGGTAAGTGTACTTGTGTTAAGCTACACTCTGG；
[0021] 正向外侧引物F3G:沈Q ID N0:13:TCAAGTATACTTCAAAGGACATT;
[0022] 反向外侧引物B3G:沈Q ID N0:14:AGTAAGGTGGAGTGGGTT;
[002；3]正向内侦J 引 物 FIPG:SEQ ID N 0 : 1 5 ： CCAAGTGCACTTTCCAGTACACCTACGCATTTATATAGAGGATGC；
[0024] 反向内侦J 引 物 BIPG:SEQ ID N 0 : 1 6 ： GAACCAGAGTGTAGCTTAACACAAAGCTAGGTTTAGCTCAGAGCo
[0025] 优选地，所述SEQ ID NO: 1-4所示的序列是用于检测1494位点的C等位基因。
[0026] 优选地，所述SEQ ID NO:5-8所示的序列是用于检测1494位点的T等位基因。
[0027] 优选地，所述SEQ ID NO:9-12所示的序列是用于检测1555位点的A等位基因。
[0028] 优选地，所述SEQ ID NO:13-16所示的序列是用于检测1555位点的G等位基因。
[0029] 本发明根据LAMP的特点，针对线粒体12sRNA上1494和1555位点的不同突变碱基设 计特异性引物，既保留了 LAMP反应的优势，又具有非常高的特异性。外侧引物记为正向外侧 引物F3和反向外侧引物B3,内侧引物记为正向内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包 含了F1C和F2，BIP包含了B1C和B2，上述引物均由在线软件PrimerExplorer V4设计。本发明 在普通LAMP的基础上，针对1555和1494位点设计等位基因特异引物，特异性引物位于Flc或 Blc的5'端，在Flc或Blc的5'端第Ξ位再引进一个突变，进一步降低非特异性扩增的可能 性。
[0030] 第二方面，本发明提供一种检测药物性耳聋的反应体系，所述反应体系包括第一 方面所述的引物组，反应缓冲液，dNTPs，径基糞酪蓝，甜菜碱，Bst DNA聚合酶，待检样品基 因组DNA和去离子水。
[0031] 优选地，所述反应缓冲液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0032] 优选地，所述Tris-HCl 的浓度为 10-30mM，例如可 W是 10mM、llmM、12mM、13mM、 151111、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，优选为15-251111，进一步优选为 20mM〇
[0033] 优选地，所述 KC1 的浓度为 10-60mM，例如可 W 是 1 OmM、1 ImM、12mM、15mM、18mM、 20mM、23mM、2 日mM、30mM、3 日mM、40mM、4 日1111、5〇1111、51111]\1、52111]\1、531111、541111、5日1111或6〇1111，优选为 50-55mM，进一步优选为50mM。
[0034] 优选地，所述(畑4) 2 S〇4 的浓度为 5-13mM，例如可 w 是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、1 OmM、 "mM、12mM或13mM，优选为8-12mM，进一步优选为1 OmM。
[0035] 优选地，所述 MgS〇4 的浓度为 2-8mM，例如可 W 是 2111]\1、31111、41111、5111]\1、6111]\1、71111或81111， 优选为2-6mM，进一步优选为4mM。
[0036] 优选地，所述Tween-20的体积分数为0.1-1 %，例如可W是0 .!%、0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%、0.6%、0.7%