一种燕窝制品实时荧光pcr鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及燕窝的鉴定方法。
【背景技术】
[0002]燕窝是中国自明代以来开始被食用的传统名贵食品之一，是指雨燕目雨燕科金丝燕属的几种金丝燕摄食的昆虫、海藻、银鱼等物经消化后，分泌出来的唾液与绒羽等混合筑成的巢窝。燕巢呈半月形，，直径6?7厘米，基底厚，廓壁薄，重约5?15克。燕巢外围整齐，内部粗糙，有如丝瓜网络。主要产自印尼、马来西亚、泰国和越南等东南亚国家。
[0003]中医认为燕窝:〃养阴润燥、益气补中、治虚损、咳痰喘、咯血、久痢”，适宜于体质虚弱，营养不良，久痢久疟，痰多咳嗽，老年慢性支气管炎、支气管扩张、肺气肿、肺结核、咯血吐血和胃痛病人食用。研究发现燕窝含有丰富的活性蛋白质，以及钙、磷、铁等微量元素。其含有的表皮生长因子和水溶性物质能够刺激细胞分裂、再生和组织重建，促进人体康复。同时能增强人体免疫力，抵抗病毒和感冒。由于燕窝具有较高的营养和保健价值，市场对燕窝制品的需求量日益增加。一些商贩以银耳、猪皮、琼脂、果胶等原料伪造燕窝制品，危害了消费者的利益。
[0004]目前燕窝真伪鉴定方法主要是经验鉴别法、显微鉴别法和仪器鉴别法(包括凝胶电泳法、红外光谱法、气相色谱法等)。这些方法中有的准确性不高，灵敏度低；有的提取纯化程序冗长，重现性不好；有的鉴别成本高昂。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，解决以上技术问题。
[0006]本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现:
[0007]一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0008]步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；
[0009]步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；
[0010]首先，在PCR反应管中加入2XPCR Master Mix 12.5 μ L，上游引物和下游引物各
0.5-1 μ L，Taqman 探针 0.5-1 μ L，50ng/μ L 待检燕窝制品 DNA1-2 μ L，补充双蒸水至 25 μ L，混匀；
[0011]其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0012]a.94-95 °C 5min，I 个循环，预变性；
[0013]b.94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，40 个循环，PCR 扩增；
[0014]步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。
[0015]本发明的主要原理是燕窝主要来自金丝燕的唾液，里面含有金丝燕的DNA，通过检测燕窝中的金丝燕12S rRNA基因来鉴别燕窝的真假。如果燕窝制品中能检出金丝燕特异性12S rRNA基因，则待检燕窝制品为真燕窝；如果未检出金丝燕特异性12S rRNA基因，说明待检燕窝制品为假冒燕窝。
[0016]本发明特异性好、灵敏度高的特点，简单快速，整个检测过程只需要3?4小时。
[0017]步骤一中，待检燕窝制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
[0018]在步骤二与步骤三之间，进行DNA浓度的测定，将DNA浓度调整为50ng/ μ L，首先使用紫外分光光度计检测提取待检燕窝制品DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值在1.7?2.0之间，按以下公式计算DNA浓度:
[0019]C = A*N*50 ;
[0020]其中C— DNA浓度，单位为ng/ μ L ;
[0021]A — 260nm处的吸光值；
[0022]N — DNA稀释倍数；
[0023]将DNA浓度稀释到50ng/ μ L0
[0024]步骤二中，通过对金丝燕特异性12S rRNA基因进行扩增。
[0025]通过特异性扩增金丝燕的12S rRNA基因序列对燕窝进行鉴定，扩增的DNA片段大小为144bp。
[0026]步骤二中，扩增金丝燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan探针的序列如下:
[0027]上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’
[0028]下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’ ；
[0029]TaqMan 探针序列:
[0030]5，-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3，，
[0031]其中5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
[0032]在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的浓度为lOymol/L。
[0033]本发明根据金丝燕的12S rRNA基因特异性序列设计一对组引物(上游引物SffT-F:5’ -GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’ 和下游引物 SWT_R:5’ -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3 ’)和一条 Taqman 探针(探针 SWT-P 序列为:5 ’ -FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94?95°C—定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团，当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’ 一5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反应模板数量。
[0034]本发明对待检燕窝制品进行检测时，每个待检燕窝制品同时做两个平行。
[0035]步骤二中，对金丝燕成分实时荧光PCR扩增时，应设立三个对照:阳性对照(金丝燕基因组DNA)、阴性对照(非金丝燕基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)；
[0036]并且，同时扩增真核生物18S rRNA基因和金丝燕12S rRNA基因。
[0037]步骤二中，同时检测真核生物18S rRNA基因以判断是否从待检燕窝制品中提取适宜进行实时荧光PCR的DNA或提取的DNA中是否存在PCR反应抑制因子；
[0038]步骤二中，分别配置真核生物18S rRNA基因和金丝燕12S rRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探针。
[0039]本发明涉及的真核生物18S rRNA基因引物和探针序列参考标准GB/T25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》:
[0040](I)上游引物 18S-F:5’ -CCTGAGAAACGGCTACCAC-3，；
[0041](2)下游引物 18S-R:5’ -CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’ ；
[0042](3) TaqMan 探针 18S-P:5’ -TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’，其 5’ 端标记 FAM 报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
[0043]步骤三，分析扩增结果时，应设置的各种对照实时PCR检测结果应全部符合以下情况，否则应重做实验:
[0044]a.阳性对照的真核生物18S rRNA基因和金丝燕12S rRNA基因都出现扩增曲线，Ct值小于30 ;
[0045]b.阴性对照的真核生物18S rRNA基因出现扩增曲线，Ct值小于30，金丝燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值彡40 ；
[0046]c.空白对照的真核生物18S rRNA基因和金丝燕12S rRNA基因都未出现扩增曲线，Ct值Ct值彡40。
[0047]此外，待检燕窝制品的真核生物18S rRNA基因实时PCR检测结果Ct值应小于30，否则重新提取DNA。
[0048]只有在满足以上两种情况下，判断待检燕窝制品是否含有燕窝成品，判断方法如下:
[0049]a.如待检燕窝制品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性待检燕窝制品出现典型阳性扩增曲线，阴性待检燕窝制品盒空白对照无扩增)，则可判定该待检燕窝制品检测出燕窝成分；