一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种分泌抗哇诺酬类药物单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002] 哇诺酬类(QuinoIones，QNs)是一类化学合成的抗菌药，由于运类药物高效低毒、 价格低廉，所W多年来被广泛应用于畜禽、水产养殖领域，用于预防和治疗疾病。过量或不 当使用哇诺酬类药物会造成其在动物农产品中残留和蓄积。哇诺酬类药物品种繁多，其在 动物体内还会转化生成多种其它哇诺酬类药物，而且即使用的是兽用药，在体内也会转化 成临床药物品种。
[0003] 人体摄入被QNs污染的农产品后，除了可能会引起关节病变、消化道反应、肝肾毒 性、血液系统毒性等不良反应，长期食用含低剂量的抗菌素，机体还会产生耐药性，甚至产 生超级细菌，从而不利于该类药物对人类疾病的治疗。
[0004] 目前，对于哇诺酬类药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法、液相-串联质谱 法，运些方法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长、不能用于现场 检测，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入制度实施对检测方法时效 性的需求。利用抗体与抗原的反应为核屯、发展起来的免疫学检测方法主要有:酶联吸附免 疫法巧LISA)和免疫胶体金法(GICT)分别具有高通量检测和操作简便、快速等优点，因而尤 其适合在基层单位的应用和现场快速检测。
[000引开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果假阳性、假阴性率 偏高，还有其核屯、原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是 由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决 定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水 时，再抽取腹水获得抗体，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动 物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大;而有些国家 和地区禁止在动物体内制备抗体。
[0006] 申请公布号为CN102618502A的发明专利申请文献公开了一种分泌抗哇诺酬类药 物单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用，该细胞株的保藏编号为CGMCC N05608,能够分泌亚 型为IgGlK链的单克隆抗体，经间接竞争化ISA分析表明该单抗与环丙沙星、恩诺沙星、氧氣 沙星、达氣沙星等哇诺酬类药物有特异反应，IC50为3.65ng/mL可用于检测食品中哇诺酬类 药物的残留。
[0007] 申请公布号为CN101792738A的发明专利申请文献公开了一种环丙沙星单克隆抗 体细胞株及其单克隆抗体，该细胞株由骨髓瘤细胞与产生抗环丙沙星抗体的脾细胞融合制 备而成，保藏编号为CCTCC NO. C200947，能够与环丙沙星、恩诺沙星攒在90 %的交叉反应， 而氧氣沙星、双氣沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿均无交叉反应，IC5G为3.45ng/mL，实现 在水产品中快速检测残留的环丙沙星。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种分泌抗哇诺酬类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该 杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗哇诺酬类药物的单 克隆抗体。
[0009] -种分泌抗哇诺酬类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株 5H1E犯8D7H12,已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中屯、（化ina Center for Type Culture Collection,简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C2015118;中国典型培养物 保藏中屯、的地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0010] 本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备哇诺酬类药物检测试剂盒中的应用。
[0011] 本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测哇诺酬类药物的试纸条中的应 用。
[001引本发明提供了 一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：
[0013] (1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得 能够产生抗哇诺酬类药物抗体的脾细胞；
[0014] (2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
[0015] 其特征在于，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10~30;所述偶联物的 偶联比为2~6:1。
[0016] 作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
[0017] 具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。
[0018] 本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株或其传代 细胞株分泌产生。
[0019] 具体地，所述单克隆抗体的亚型为IgGU链，与哇诺酬类药物有特异性反应。
[0020] 作为优选，所述单克隆抗体通过体外培养的方式获得。
[0021] 本发明还提供了所述的单克隆抗体在检测哇诺酬类药物中的应用。
[0022] 本发明还提供了所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留哇诺酬类药物 中的应用。
[0023] 作为优选，所述的哇诺酬类药物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氣沙星、诺氣沙星、丹诺 沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氣沙星、洛美沙星、双氣沙星、依诺沙星、氣甲哇、加替沙星、嗯 哇酸、氣罗沙星和司帕沙星中的至少一种。
[0024] 本发明还提供了一种哇诺酬类药物的检测试剂盒，含有所述的单克隆抗体。
[0025] 具体地，所述的试剂盒中含有所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克 隆抗体、酶标板、哇诺酬类药物标准品，酶标记物(酶标二抗）、底物和终止液，其中，酶标板 上包被有人工合成的抗原(竞争物）。使用时，待待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再 加入酶标记物，若样品中含有哇诺酬类药物，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入 底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的哇诺酬类药物量成反比。根据哇诺酬类药物 标准品做出的标准曲线，计算出样品中的哇诺酬类药物的含量。
[0026] 本发明还提供了一种用于检测哇诺酬类药物的试纸条，包括:样品垫、标记物垫、 反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记、巧光标记或量子点标记的由所述杂交 瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0027] 本发明的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有环丙沙星-卵清蛋白偶联 物(CIP-0VA)，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述二抗选用羊抗鼠 IgG。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
[0029] 本发明W环丙沙星与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将 免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培 养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株;该杂交瘤细胞株分泌的单克隆 抗体灵敏度高，特异性强，可用于哇诺酬类药物的快速、准确免疫检测和免疫分析。
【附图说明】
[0030] 图1为免疫抗原环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的质谱图；
[0031] 图2为单抗对环丙沙星(CIP)间接竞争化ISA的标准曲线；
[0032] 图3为杂交瘤细胞株甜化犯8D7H12的染色体标本；
[0033] 图4为重组纯化蛋白（Protein G)纯化抗体电泳图；
[0034] 图5为免疫胶体金法检测猪肉添标样本中的哇诺酬类药物的结果。
【具体实施方式】 [003引实施例1
[0036] 杂交瘤细胞株5H化犯8D7H12于2015年8月26日送达中国典型培养物保藏中屯、（地 址：中国.武汉.武汉大学），该细胞株的存活性于2015年9月10日检测结果为存活，保藏编号 CCTCC No:C2015118〇
[0037] 该杂交瘤细胞株通过环丙沙星(CIP)与牛血清白蛋白（BSA)的偶联物(CIP-BSA)为 抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫后小鼠的脾脏细胞与经复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采 用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经过筛选和4次克隆获得。具体过程如下：
[0038] 1.免疫抗原(CIP-BSA)的合成
[0039] (1)称取牛血清白蛋白（BSA) 125mg，碳二亚胺化DC)90mg，加4.5mL水溶解，制成A 液。
[0040] (2)称取盐酸环丙沙星（Ciprofloxacin hy化ochloride，简称CIP，CAS号：86483- 48-9分子式:Ci7化9CIFN3化分子量:367.8) 15mg，加水1.5mL溶解后制成B液，将B液加入A液。
[0041] (3)将上述混合后的溶液置于摇床上，4°C避光震荡1她W上，上下颠倒5次。
[0042] (4)收集反应液，先用O.lmol/L化0H溶液透析化，再用PBS(7.4)透析3天，换水6 次，得CIP-BSA溶液。
[0043] (5)用考马斯亮蓝染色法检测抗原蛋白浓度：CIP-BSA溶液稀释40倍，测得值 0.2420 mg/mL，原溶液浓度为9.68mg/mL。
[0044] (6)用高分辨率离子阱质谱检测CIP-BSA分子量为67995.2734道尔顿（见图1)，W 相同方法测得BSA分子量为66366.2578道尔顿，计算偶联比为：
[004引2.包被抗原(CIP-0VA)的合成
[0046] (1)称取卵清蛋白（0VA)125mg，邸C 90mg，加4.5mL水溶解，制成B液。
[0047] (2)称取CIP 15mg，加水1.5mL溶解后，加入B液。
[0048] (3)将上述混合后的溶液置于摇