一种乳酸球菌菌株m23及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种乳酸球菌M23及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着抗生素在畜牧生产中大量使用所带来的种种弊端的日益凸显，如导致动物肠 道正常菌群失调，动物整体免疫低下，产生耐药性细菌甚至发生抗生素在畜禽产品中的残 留，开发替代抗生素的新型环保安全高效的绿色饲料添加剂已成为必然趋势。
[0003] 近年来，益生菌替代抗生素来促生长、预防和治疗炎症性肠病成为研究的热点，益 生菌在动物生产中已有广泛的应用和研究。其中，肉鸡饲喂乳酸杆菌的研究越来越多，尤其 乳酸菌制剂在肉鸡生产中得到广泛的应用，它作为一种活性制剂能够提高肉鸡生产性能和 改善肠道环境。目前，乳酸菌种类繁多，不同的益生菌菌种、益生菌的添加水平对促生长效 应也各不相同；而且肉鸡日增重也不理想，例如现有罗伊氏乳杆菌单一菌剂、卷曲乳杆菌单 一菌剂及其它们的复合制剂，每克活菌含量仅为l〇7c化，肉鸡日增重均在50~52g;北京中 农颖泰生物技术有限公司研制的高端乳酸菌微生态制剂，商品名康福特100,饲喂42天肉鸡 日增重为51.97±4.75g;同时由于饲养环境的差异，益生菌结果不一致性变得越来越复杂 因此，寻找一种效果稳定、具有最佳肉鸡日增重特点、可制备活性制剂的优良乳酸菌菌种成 为进一步研究的课题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种效果稳定、具有最佳肉鸡日增重特点、可 制备活性制剂的优良乳酸球菌菌株M23及其应用。
[000引本发明解决其技术问题采用的技术方案是，
[0006] 本发明从陕西杨凌地区采样，从散养肉鸡肠道中分离筛选出一批乳酸菌，并从中 发现一株尿肠球菌，该菌命名为尿肠球菌，Enterococcus faecium JM23,该菌株JM23已保 藏于中国典型培养物保藏中屯、，其简称为JM23,保藏编号为CCTCC Μ 2015679,保藏日期为 2015年11月18日。保藏地址:湖北省武汉市武昌塔挪山，武汉大学保藏中屯、。邮编:430072
[0007] 本发明之一种乳酸球菌菌粉，包括乳酸球菌菌株Μ23。
[0008] 本发明之一种乳酸球菌菌粉的制备方法，包括W下步骤：
[0009] (1)制备乳酸球菌菌株Μ23的种子液；
[0010] (2)制备发酵液:将步骤（1)中制备的种子液转接到液体培养基中，在36~38°C培 养12~24h，作为发酵用菌种；
[0011] (3)扩大培养:在发酵罐中加入液体培养基，119~125°C灭菌15~30min;灭菌完成 后降溫降至36~38°C;将步骤(2)中制备的发酵液W体积比为0.5~2%的比例接种到液体 培养基中；在溫度36~38°C，转速100~30化pm，pH 6~7,连续发酵12~2地，即得发酵菌液；
[0012] (4)制备菌粉：将步骤（3)中所得的发酵菌液用超高速离屯、机W转速6000~ 1000化pm/min离屯、15~25min;弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重 的8~12%，然后揽拌均匀，冷冻干燥20~30h后研成粉末状，即得乳酸球菌M23菌粉。
[0013] 进一步，包括W下步骤：
[0014] (1)制备种子液:从平板上挑乳酸球菌菌株M23的单菌落接种到MRS液体培养基，在 37°C培养箱培养16h;
[001引（2)制备发酵液:将步骤(2)中制备的种子液W体积比为1%的比例转接到MRS液体 培养基中，37Γ培养16h，作为发酵用菌种；
[0016] (3)扩大培养:在发酵罐中加入MRS液体培养基，12rC灭菌20min;灭菌完成后，降 溫降至37°C;将步骤(2)中制备的发酵液W体积比为1%的比例接种到MRS液体培养基中；在 溫度37 °C，转速20化pm，pH 6.5，连续发酵16h，即得发酵菌液。
[0017] (4)制备菌粉:将发酵菌液8000g用超高速离屯、机W转速8000巧m/min离屯、20min; 弃上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保护剂，加入量为菌泥重的10%，然后揽拌均匀，冷冻干 燥24h后研成粉末状，，即得乳酸球菌M23菌粉。
[0018] 进一步，所述保护剂为脱脂奶粉和甘油按比例为5:1的混合物。
[0019] 本发明之乳酸球菌菌株M23在制备肉鸡日粮中的应用。
[0020] 进一步，每千克日粮中含109c化所述乳酸球菌M23。
[0021] 本发明之乳酸球菌菌粉在制备肉鸡日粮中的应用。
[0022] 进一步，每千克日粮中添加1克所述乳酸球菌菌粉。
[0023] 本发明之乳酸球菌菌株M23可W较好地耐受胃肠道中不利于细菌生长的因素如 酸、胆盐并且对肠道致病菌有一定的抑制作用;本发明菌株M23具有较好的可发酵性，具有 大量生产的潜力。本发明由菌株M23制备成乳酸球菌菌粉添加到肉鸡日粮中，可W显著提高 肉鸡的生产性能。
[0024] 实验证明，本发明菌株M23在pH 2.5、胆盐浓度为0.2%和0.3%的培养基中生长都 不受影响，在培养基pH为2.0时成活率依然高达72%。同时，本发明菌株M23对肠道致病菌鼠 伤寒沙口氏菌W及己氏杆菌都有一定的抑制作用。本发明菌株M23在PH 6.5、溫度37°C、转 速20化pm/min的条件下，可大量生长，发酵菌液经过低溫高速离屯、得到菌体，经过24小时冷 冻干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌数高达l〇i2cfu。肉鸡日粮中添加本发明乳酸球菌菌 粉可使肉鸡平均日增重可达59.6 ± 1.7g，饲料转化率可达1.56 ± 0.12 %。
【附图说明】
[0025] 图1为乳酸球菌M23系统发育树。
[0026] 图2为尿肠球菌M23耐酸、耐胆盐对照图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实施例对本发明进一步加 W说明。
[0028] 实施例1:乳酸菌的分离
[0029] 1、菌株样品：样品是从陕西杨凌地区散养肉鸡肠道中采集的，取肠道内容物W及 粘膜于4°C保存。
[0030] 2、培养基:MRS培养基(Man Rogosa化arp，MRS)，乳酸菌选择性培养基，组成如下： 膜蛋白lOg/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，S水合乙酸钢5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫 801ml/L，憐酸氨二钟2.0g/L，巧樣酸Ξ胺2.0g/L，屯水合硫酸儀0.58g/L，一水硫酸儘 0.25g/l，碳酸巧20g/L，琼脂15g/L，蒸馈水1L。
[0031] 3、菌株的分离:采用倍比稀释法涂布，37Γ培养2地，挑取平板上有明显溶巧圈的 单菌落，在平板上划线，多次纯化直到菌落的颜色、大小、形态完全一致;将纯化的菌落在平 板上于4°C保存，菌液与50%的甘油1:1混合80均匀后保存于-80°C冰箱。
[0032] 4、菌株形态特征及生理生化鉴定:将粪肠球菌在MRS固体培养基平板上37Γ培养 2地，形成乳白色的圆形菌落，边缘整齐光滑。经经革兰氏染色、过氧化氨、硝酸盐、硫化氨等 试验鉴定，粪肠球菌的生理生化特征为:革兰氏染色阳性，球状;出S反应、过氧化氨酶、硝酸 盐还原均为阴性。
[0033] 5、活性菌株的分子鉴定:提取乳酸菌菌株的基因组，参照天根的DNA提取试剂盒提 取的，PCR引物为细菌16S rRNA序列通用引物：
[0034] 正向引物27尸(5'-46461'1764了〇：了66(：1^46-3')，如沈0 10^:1所示；
[003引反向引物14923(5'-667^0：1767^〔64(：1'1'-3')，如沈0 10備:2所示；
[0036] 扩增菌株leSrRNA基因，PCR反应体系：20微升体系，mix 10微升，上下游引物各1微 升，基因组1微升，灭菌水7微升;PCR反应条件为:95°C10min;95°C30s;55°C30s;72°C90s;30 个循环，72°C延伸lOminJCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，用全式金的胶回收 试剂盒回收片段，回收样品送送南京金丝瑞测序公司测序，将测序的结果输入NCBI网站上 的BLAST程序进行比对，结果显示菌株M23与GenBank基因库中肠球菌属中的linterococcus faeciumEnterococcus faecium的 16S rRNA序列同源度最高，同源率达98.98%。
[0037] 6、菌株系统发育分析:将菌株的16S rRNA序列与从GenBank数据库中获得的粪肠 球菌16S rRNA序列作比较，DNAStarlOO软件包进行多序列匹配排列并进行系统进化树构建 见图1。从该菌16S rRNA构建的系统发育树上看，菌株M23与粪肠球菌Enterococcus faecium发育关系最近，分在同一类群中，序列同源性为98.98%。根据生物学领域的通常认 知，16S rRNA基因序列同源性小于93%~95% ,可认为属于不同属，同源性低于98%，可W 认为属于不同种。因此，基于系统发育树和16S rRNA同源性角度，菌株M23是肠球菌属中的 一个新成员，将其命名为linterococ州S faecium M23。
[0038] 综上，根据形态学特性、生理生化特征、分子生物学鉴定，并结合文献报道，确定菌 株M23为乳酸球菌M23。
[0039] 实施例2:乳酸球菌M23耐酸、耐胆盐的研究
[0040]