包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物的利记博彩app
【专利说明】包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年9月24日提交的美国临时申请号61/881，834(其全文以引用方 式并入本文)的权益。
[0003] 序列表的参考
[0004] 根据37CFR§1.821，以计算机可读形式(CRF)经由EFS-Web随本文同时提交的文件 名为PC72049_SEQLIST_ST25. txt的序列表以引用方式并入本文。所述序列表的电子复本在 2014年9月10日创建，文件大小为31千字节。
[0005] 发明背景
[0006] 对于能够在一系列其中无法通过医疗或外科干预适当地控制出血的临床病况中 控制过量出血的有效疗法是有需求的。此种未被满足的需求在患有血友病的患者，尤其是 在那些由于产生抑制性抗体而使因子替代疗法的有效性减小的患者中是特别关键的。
[0007] 经活化的凝血因子X(FXa)在内因性和外因性凝血通路会聚处的凝血级联中占据 中心位置。与膜结合的FXa在其辅因子Va (FVa)的存在下将凝血酶原转化成凝血酶，该凝血 酶活化血小板并将纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成血栓。原则上，直接施用FXa的替代疗 法可以矫正出血。然而，由于FXa的血浆半衰期非常短且可能因其它凝血因子的活化而引起 过度凝血，所以其治疗潜力受到限制。
[0008] 早期的工作鉴定出一种FXa变体(I16L变体），其中亮氨酸取代野生型FXa重链的氨 基末端处的异亮氨酸(在胰凝乳蛋白酶编号方案中的位置16)。所述取代产生具有酶原样特 征的FXa变体。Toso，R.等人，The conformational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly .J.Biol.Chem .283.186 27-18635(2008); I vane iu L ·等人，A zymogen-1 ike factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia.Nat.Biotechno1.29:1028-33(2011)〇
[0009] 当不与其辅因子Va(FVa)掺入凝血酶原酶复合物中时，FXa I16L变体不具有显著 的催化活性并且与野生型FXa相比，受到较好的保护而免于被血清蛋白酶抑制剂去活化。因 此，与野生型FXa相比，该变体具有较长的血清半衰期。然而，与凝血酶原酶中的FVa结合导 致该变体从酶原样状态转换至活性构象，从而恢复该变体催化凝血酶原转化成凝血酶的能 力并从而恢复其促凝血活性。在血友病A和血友病B的小鼠模型中，在受伤前施用FXa I16L 变体在截割尾巴后以剂量依赖方式减少失血。这些实验的结果表明FXa I16L变体可用于治 疗人血友病患者中不受控制的出血。
[0010]然而，在早期研究中所使用的FXa I16L变体从经稳定转染的HEK293细胞小量制 造，再使用鲁塞尔氏蜂蛇毒蛋白酶(Russell's viper venom protease)RVVX活化FX蛋白。 Toso,R.jZhUjH.&Camire,R.M.The conformational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly. J.Biol.Chem. 283,18627-18635(2008)。虽然对于小规模的研究是有用的，但此 方法不适合用于大量制造临床研究和最终供给病人所需的经纯化的FXa变体蛋白。因此，本 领域需要制备FXa I16L变体蛋白，所制造的量和纯度使FXa I16L变体蛋白可在临床试验中 进行测试且被批准后可提供给需要止血的受试者。
[0011] 发明概述
[0012] 本公开内容通过提供FXa变体蛋白的组合物来解决上述本领域中未被满足的需 求，所述FXa变体蛋白以足够的纯度和数量制造而能提供给需要止血的受试者。在多个实施 方案中，这些组合物包含FXa变体蛋白的不同的同工型和翻译后修饰。
[0013] 在一个实施方案中，组合物包含FXa变体蛋白的β型，其中轻链和重链蛋白序列分 别由下列组成：SEQ ID Ν0:1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至386、氨基酸1至140和 146至384、氨基酸1至140和146至386、氨基酸1至141和146至384、氨基酸1至141和146至 386、氨基酸1至142和146至384、氨基酸1至142和146至386、氨基酸1至143和146至384、以及 氨基酸1至143和146至386、所有氨基酸。
[0014] 在另一个实施方案中，组合物包含FXa变体蛋白的α型，其中轻链和重链蛋白序列 分别由下列组成:SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至398、氨基酸1至140和 146至398、氨基酸1至140和146至399、氨基酸1至141和146至398、氨基酸1至141和146至 399、氨基酸1至142和146至398、以及氨基酸1至142和146至399、所有氨基酸。
[0015] 在上述的FXa变体蛋白的任一个或多个β和α同工型实施方案中，所述蛋白的轻链 可经修饰以包含β-羟基Asp63、0-连接的己糖和9、10或11个Gla残基。在一些实施方案中，存 在9个Gla残基。在其它实施方案中，存在10个Gla残基。在其它实施方案中，存在11个Gla残 基。
[0016] 在上述的FXa变体蛋白的任一个或多个β同工型实施方案中，重链可经修饰以包含 一或两个核心-10-连接的聚糖。在一些实施方案中，仅第一个、仅第二个或两个核心-10-连 接的聚糖可以是未经唾液酸化、经单唾液酸化或经二唾液酸化的。根据一些实施方案，不存 在唾液酸基团。在其它实施方案中，存在一个唾液酸基团。在其它实施方案中，存在两个唾 液酸基团。在进一步的实施方案中，存在三个唾液酸基团。在更一步的实施方案中，总共存 在四个唾液酸基团。
[0017] 根据一些实施方案，FXa变体蛋白组合物包含本公开内容的表2所列的至少一种 FXa变体蛋白种类。在其它实施方案中，本公开内容的组合物包含表2所列出的FXa变体蛋白 种类的至少5种、至少1〇种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、 至少45种、至少50、至少55种或至少60种。
[0018] 根据其它实施方案，FXa变体蛋白组合物包含至少一种其中轻链为本公开内容的 表3所列出的种类的FXa变体蛋白。且在其它实施方案中，FXa变体蛋白组合物包含至少一种 其中重链为本公开内容的表4所列出的种类的FXa变体蛋白。
[0019] 在一些实施方案中，本公开内容的任一种或多种FXa变体蛋白可以以相对于可能 存在的其它种类而改变的平均丰度存在于组合物中。例如，相较于存在的其它种类，特定的 种类可以以主要丰度、次要丰度或微量丰度存在。或者，相较于存在的其它种类，特定的种 类可以以高丰度、中等丰度、低丰度或非常低的丰度存在。
[0020] 本公开内容还提供了用于制造和纯化FXa变体蛋白的核酸、载体、宿主细胞和方 法。
[0021 ]例如，包括了编码FX变体蛋白的核酸序列，所述FX变体蛋白包含以PACE加工位点 替换天然活化肽(AP)序列，从而允许凝血因子的细胞内活化。在一些实施方案中，AP序列被 完全去除并被氨基酸序列Arg-Lys-Arg取代。根据一些实施方案，编码FX变体蛋白的cDNA序 列由SEQ ID N0:4的核酸序列提供，而由其编码的氨基酸序列由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列 提供。提供了用于通过生长共表达PACE(或类似的蛋白酶)和FX变体蛋白的宿主细胞和随后 纯化由宿主细胞产生、加工和分泌的FXa变体蛋白来制造 FXa变体蛋白的相关方法。还公开 了根据这些方法所产生的FXa变体蛋白。在这些方法的一些实施方案中，宿主细胞为CH0细 胞。
[0022] FXa变体蛋白的纯化可通过色谱法来进行，包括将包含所述蛋白的溶液通过混合 模式色谱(丽C)柱（例如使用Capto MMC介质），随后进行清洗和洗脱，然后将所述蛋白通过 第一个离子交换色谱柱(例如使用Q-Sepharose Fast Flow介质），随后进行清洗和洗脱，然 后将所述蛋白通过第二个不同的离子交换色谱柱(例如使用Fractogel SOf介质），随后进 行清洗和洗脱。还可能的是使用用于纯化FXa变体蛋白的其它方法。
[0023]纯化方法可任选地包含病毒去活化的步骤，以及超滤和渗滤的步骤。在将FXa变体 蛋白纯化和在一些情况下浓缩后，可将其在任选地含有其它成分(诸如缓冲剂或赋形剂）的 药学上可接受的稀释剂中稀释。
[0024] 本公开内容还提供了治疗需要止血的受试者的方法，此方法通过施用止血有效量 的包含本公开内容的一种或多种FXa变体蛋白的组合物来进行。在其它实施方案中，在出血 前给受试者施用止血有效量的包含本公开内容的一种或多种FXa变体蛋白的组合物，以预 防性地防止易感受试者中不受控制的出血。在一些实施方案中，针对血友病A治疗受试者。 在其它实施方案中，针对B型血友病治疗受试者。在其它实施方案中，针对外伤或其它类型 的不受控制的出血治疗受试者。
[0025] 附图简述
[0026]图1A提供成熟FX变体蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)，其中在位置146的野生型 异亮氨酸残基被以粗体显示的亮氨酸取代。位置146对应于胰凝乳蛋白酶编号系统中的位 置16。潜在的γ-羧基谷氨酸残基(Gla)下方划线且为斜体字。预测的链内和链间二硫键通 过绘于相连接的半胱氨酸之间的线表示。预测的β-羟基化位点由具有实线的框包围。经工 程改造以替代活化肽的PACE识别和切割位点由具有虚线的框包围。形成重链的β型的羧基 末端氨基酸的赖氨酸(Lys 386)由具有实线的椭圆形包围。图1Β提供成熟FX变体蛋白轻链的 预测的氨基酸序列（SEQ ID N0: 2)。图1C提供FXa变体蛋白重链的预测的氨基酸序列（SEQ ID N0:3)。图1D提供编码FX变体蛋白的cDNA的核苷酸序列（SEQ ID N0:4)，包括信号序列和 前肽。
[0027]图2提供完整FXa变体蛋白的纯化制剂在还原、烷基化反应和以Lys-C进行蛋白水 解消化后所得到的肽的质谱图。使用基于肽在进行RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析后所得的质 谱图的波峰分配来确认蛋白的氨基酸序列和鉴定表1及本文其它地方所描述的某些翻译后 修饰。波峰标记如下。后面跟着数字的"L"指源自轻链的特定的肽。后面跟着数字的"H"指源 自重链的特定的肽。"H20 1"：终止于Lys399的Η链C末端α型，含有两个经二唾液酸化的核心-10-聚糖。"Η202"：终止于Lys 399的Η链C末端α型，含有一个经二唾液酸化的核心-10-聚糖。 "Η203" ：终止于Leu398的Η链C末端α型，含有一个经二唾液酸化的核心-10-聚糖。"L41Gla" ：含 有1个γ-羧基谷氨酸残基的L链肽#4。11(^~：含有潜在的0-连接的葡萄糖（己糖）的1^链 肽#10。112(^"：具有2个丫-羧基谷氨酸残基的1^链肽#1。1361 13"：具有6、7或8个丫-羧基 谷氨酸残基的L链肽#3。"L8b-QH" ：含有β-羟基Asp的L链肽#8。"d" ：脱酰胺化。"R" ：试剂峰， 即，与试剂空白组一致的缓冲剂相关产品。：过烷基化。
[0028]图3提供完整FXa变体蛋白的纯化制剂的HPLC色谱图并证明在所述制剂中存在不 同的FXa变体蛋白同工型。
[0029]图4提供完整FXa变体蛋白的纯化制剂的HPLC色谱图并证明在所述制剂中存在不 同的FXa变体蛋白同工型。还可通过质谱法分析所述制剂。
[0030]图5提供来自纯化的制剂的完整FXa变体蛋白的质谱图。质谱图确认两种主要同工 型(α和β)的存在，以及广泛的质量异质性，所述广泛的质量异质性可归因于PACE切割位点 的可变消化和不同类型的翻译后修饰的存在。图中的主峰通过其观察质量（以道尔顿计)来 鉴定。使用基于RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析后所得的质谱图的波峰分配来确认蛋白同工型 的氨基酸序列，并鉴定表2和本文其它地方所描述的某些翻译后修饰。标记的峰表示在 轻链Gla结构域中存在11个Gla残基。
[0031 ]图6提供FXa变体蛋白的纯化制剂在通过消除链间和链内二硫键将轻链和重链分 开的还原和烷基化反应后的HPLC色谱图。所述色谱图证明不同FXa变体蛋白同工型的存在。 还通过质谱分析法分析所述制剂。
[0032] 图7A提供FXa变体蛋白轻链在该蛋白的纯化制剂的还原和烷基化反应后的质谱 图。该质谱图证明可归因于PACE切割位点的可变消化和不同类型的翻译后修饰的存在的广 泛质量异质性。图中的主峰通过其观察质量（以道尔顿计)来鉴定。使用基于RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析后所得的质谱图的波峰分配来确认蛋白同工型的氨基酸序列，并鉴定表3和本 文其它地方所描述的某些翻译后修饰。
[0033] 第7B图提供FXa变体蛋白重链在该蛋白的纯化制剂的还原和烷基化反应后的质谱 图。该质谱图证明可归因于不同类型的翻译后修饰的存在的广泛质量异质性。图中的主峰 通过其观察质量（以道尔顿计)来鉴定。使用基于RP-HPLC/ESI-QTOF MS分析后所得的质谱 图的波峰分配来确认蛋白同工型的氨基酸序列，并鉴定表4和本文其它地方所描述的某些 翻译后修饰。标记"的峰表示重链的过烷基化。
[0034]发明详述
[0035]本文描述了包含以足以在临床试验中测试和提供给需要止血的受试者的纯度和 量产生的FXa变体蛋白的组合物。还描述了制造和纯化FXa变体蛋白的方法。
[0036]在某些实施方案中，短语"FX变体蛋白"、"FXa变体蛋白"和类似术语分别指(除非 从上下文中另外明确得知)人因子X(FX)或活化的因子X(FXa)，其中在重链中紧接活化肽序 列之后的异亮氨酸（lie或I)被亮氨酸(Leu或L)取代。基于FXa重链和胰凝乳蛋白酶的催化 结构域之间的序列比对，该取代也被称为使用胰凝乳蛋白酶编号方案的I16L取代突变。该 位置对应于SEQ ID N0:1中的氨基酸146和SEQ ID N0:3中的氨基酸1。如上文所讨论的，包 含此突变的FXa具有允许其相较于野生型FXa在血液中循环更久的酶原性质，但当被掺入凝 血酶原酶复合物中时，还能以高速率切割凝血酶原。
[0037]根据其它实施方案，FX变体蛋白和FXa变体蛋白分别指人FX或FXa，其中对应于SEQ ID N0:1中位置146(胰凝乳蛋白酶编号方案中的位置16)的氨基酸被Phe(F)、Asp(D)或Gly (G)取代。根据其它实施方案，FX变体蛋白和FXa变体蛋白分别指人FX或FXa，其中对应于SEQ ID NO: 1中位置147 (胰凝乳蛋白酶编号方案中的位置17)的缬氨酸(Va 1或V)被Leu(L)、Ala (A)或Gly(G)取代。以及，在其它实施方案中，FX变体蛋白和FXa变体蛋白分别指人FX或FXa， 其中对应于SEQ ID NO: 1中位置329(胰凝乳蛋白酶编号方案中的位置194)的氨基酸被Asn (N)或 Glu(E)取代。
[0038] 野生型因子X通常以通过二硫键结合在一起的非活性二链酶原形式在血液中循 环。二链酶原由成熟FX(即，缺乏信号肽和前肽)在蛋白水解除去肽Arg-Lys-Arg(在成熟蛋 白中存在为氨基酸140-142的）之后形成。然而，活化需要在形成凝血块前通过因子IXa或因 子Vila或通过其它蛋白酶诸如RVVX除去活化肽(APhAP对应于成熟单链FX的氨基酸143-194。在二链酶原中，它存在于重链的氨基末端。M.Hertzberg,Biochemistry of factor X， Blood Rev.8(l):56-62(1994)〇
[0039] 在示例性实施方案中，因子X变体蛋白序列通过下述步骤修饰:除去活化肽并以氨 基酸序列Arg-Lys-Arg(单字母代码为RKR)替换其，以生成针对成对碱