快速区分仿刺参来源地的随机扩增多态性dna方法及实现所述方法的引物的利记博彩app
【专利说明】快速区分仿刺参来源地的随机扩増多态性DNA方法及实现所 述方法的引物 【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及海参的分子生物学鉴定，特别是通过随机扩增 多态性DNA对三种不同来源地的仿刺参进行快速鉴定的方法。 【【背景技术】】
[0002] 海参是棘皮动物门海参纲动物的统称，是名贵海味并具有重要的药用价值。其中， 仿刺参(Aposti chopus japonicus)俗称辽参，属于楣手目、刺参科、仿刺参属，是我国经济 价值最高的海参品种。种群主要分布于辽、冀、鲁、苏等北方沿岸浅海区，在日本北海道、俄 属海参崴、朝鲜半岛也有生长。然而，商业利益也催生了如掺假、造假等不法行为，特别是譬 如伪造产地、以次充好等，所以对市面上所销售种类繁多的海参进行物种分类和来源地鉴 定势在必行。
[0003] 目前，鉴定海参种类及产地的方式主要有形态学鉴定、物理学方法鉴定、化学方法 鉴定以及分子生物学方法鉴定。其中传统鉴定方法过程繁琐复杂、耗时耗力、准确性低，难 以适应现代工业的鉴定要求。
[0004] 分子生物学方法以核酸为研究对象，具有特异性好、灵敏度高、耐热性强等优点， 利用DNA条形码技术对海参物种进行鉴定，例如线粒体细胞色素 c氧化酶亚基I (Mitochondrial cytochrome coxidase subunitI，C0I)由于存在显著的序列变异而被认 为是一种合适的DNA分子标记。
[0005] 例如中国专利申请CN 201410010808.8公开了一种刺参科17种经济海参基于⑶I 基因的PCR-RFLP鉴别方法，其通过分子生物学方法基于C0I基因对样品基因片段进行PCR-RFLP反应，结合电泳检测和谱带判断海参样品的品种。然而，该方法只能检测海参的品种， 而对于同品种的海参却无法分辨其来源地。
[0006] 至于海参产地的鉴别研究，现代技术利用近红外光谱法、ICP-MS进行研究，但上述 方法的特点是操作复杂，成本较高，且一般实验室难以开展，故亟需发明一种简单易行且准 确的鉴定方法。
[0007] 随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNAJAFO)技术是由美 国科学家WilliamS、WelSh等于1990年提出的一项DNA多态性分析技术。其原理是采用短的 单一引物，一般约为10个碱基，通过PCR反应对目标生物的基因组DNA进行扩增，然后用聚丙 烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，产物的电泳条带在数量、大小位置、明暗等方面表 现出很强的特异性，反映出目标生物基因组DNA的多态性。 【
【发明内容】
】
[0008] 本发明的目的是对来自大连、威海和烟台的仿刺参进行快速来源地检测。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供对仿刺参进行RAPD扩增的引物，所述引物序列如 SEQ No.l 所示。
[0010] 本发明还提供含有上述引物的快速检测仿刺参来源地的试剂盒。
[0011] 本发明还涉及采用随机扩增多态性DNA的快速区分仿刺参来源地的检测方法，包 括以下步骤：
[0012] (1)对每一份仿刺参分别取待测样品，提取DNA模板；
[0013] ⑵分别以待测样品DNA为模板，如SEQ No.l所示的引物D20为随机引物进行PCR反 应；
[0014] (3)对PCR反应产物进行电泳凝胶检测；
[0015] (4)采用Ntsys软件对电泳凝胶检测所得扩增图谱进行数据统计，将图谱中的无条 带位点负值为〇,有条带位点赋值为1，通过Ntsys软件计算各个样品之间的遗传相似系数矩 阵并进行聚类分析，得到各样品的遗传距离聚类图；
[0016] (5)通过遗传距离聚类图区分仿刺参样品的来源地。
[0017] 其中，步骤（1)包括待测样品置于超纯水中浸泡4-10小时，然后称取80mg海参肌肉 柱，冲洗干净后置液氮中研碎，取30mg的肌肉柱利用Mollusc DNAkit提取海参基因组DNA， 置4°C备用。
[0018] 步骤(2)的PCR反应条件为：
[0019] 反应体系：l〇XPCR Buffer 5yL，2.5mmol/L dNTPs 4yL，5U/yL Taq 酶 0·5μL，10μ mo 1/L 引物 2yL，DNA 模板 2yL，ddH20 补足至 50yL;
[0020] PCR反应参数:95°C预变性5min，然后经过40个循环，每个循环包括:95°C lmin，45 °C lmin，72°C2min;最后 72°C 延伸 lOmin，4°C 保存。
[0021 ] 步骤(3)包括以0.5 X TBE缓冲液配置1.5 % (w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却 至60°C左右时加入10% (v/v)核酸染料，混匀后倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放 入含0.5 X TBE缓冲液的电泳槽中；再将8yL步骤(2)的PCR产物与lyL加样缓冲液混匀，依次 加入加样孔内；控制电压保持在ΙΟΟν电泳，当溴酚蓝条带泳动到2/3胶长时，停止电泳，取出 置于紫外凝胶成像系统中观察。
[0022]步骤（4)中米用非加权组平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)进行聚类分析，构建各样品的遗传距离聚类图。
[0023]与现有技术相比，本发明通过RAPD技术实现多种、多份仿刺参样品来源地的快速 区分，克服了现有技术鉴定仿刺参时存在的成本高、费时长等缺点。本发明可快速分辨大 连、威海、烟台的仿刺参，具有低成本、灵敏度高的优点。 【【附图说明】】
[0024] 图1为随机序列C11扩增产物凝胶电泳结果；
[0025] 图2为随机序列C15扩增产物凝胶电泳结果；
[0026] 图3为随机序列C16扩增产物凝胶电泳结果；
[0027] 图4为随机序列D16扩增产物凝胶电泳结果；
[0028]图5为随机序列D20扩增产物凝胶电泳结果；
[0029] 其中：1 :Marker(2000bp); 2-10大连仿刺参；11-20烟台仿刺参；21-28威海仿刺参； 29:Marker(2000bp)。
[0030]图6为根据图5的数据统计得到的不同来源地仿刺参的遗传相似系数矩阵得到的 图谱。 【【具体实施方式】】
[0031]以下通过较优实施例非限制性地解释本发明的技术方案。
[0032] 实施例1
[0033] (1)海参样品的预处理及品种确认
[0034] 分别购买来源地为大连的仿刺参9个、烟台的仿刺参9个和威海的仿刺参8个共计 26个，顺序编号，分别在Mi 11 i-Q超纯水中浸泡5小时，备用。
[0035] 分别取肌肉柱30mg，在如下反应条件和反应体系下以海参种特异性引物进行PCR 反应：
[0036]
[0051] 8.将柱子放回同样的收集管，在把剩余的液体加入，同上离心放弃液体；
[0052] 9.放柱子在2ml的新收集管用500yL HB buffer洗，lOOOOXg离心30s，放弃液体， 取柱子；
[0053] 10.放置柱子到2ml的离心管加 700yL DNA Wash buffer(提前用酒精稀释），10000 X g离心lmin，弃液体；
[0054] 11.重复第九步，再用700yL DNAWash buffer洗。然后将柱子放到空收集管中 15000g 离心 2min;
[0055] 12