含目标基因组dna片段植株的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及遗传学、基因组学和分子育种领域，具体地说，涉及全基因组选择育种 技术以及利用该技术快速精确选育含目标基因组DNA片段的植株的方法。
【背景技术】
[0002] 长期以来，传统育种的选择方法主要依赖于田间表现型的评价，根据育种家个人 经验进行取舍，其最大的缺点在于耗时长。近年来，育种家开始应用分子标记辅助选择方 法改良个别目标性状，虽然该方法的运用能显著的缩短育种年限，但仍然存在如下的缺点。 (1)非目标基因组DNA片段的导入。现有分子标记辅助选择方法的应用大多局限于单个基 因位点的选择，仅确保包含目标基因组DNA片段的导入而忽略导入片段的大小。因无法确 定导入片段大小，导致与目标基因组DNA片段连锁的非目标基因组DNA片段也被转移到待 改良材料中，即产生遗传累赘。（2)优良性状的丧失。由于无法在全基因组水平判断所选育 植株的遗传背景，存在受体亲本某些优良性状丧失的风险。（3)缺乏稳定性。选育的植株可 能因基因型不纯导致后代表型的分离。
[0003] 稻瘟病是水稻最严重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻产量损失占 11 %~30 %，因此稻瘟病及其抗性的研究显得尤为重要。随着对稻瘟病研究的逐步深入，许 多水稻抗稻瘟病基因 DNA片段相继被定位和克隆。其中，水稻第6染色体的Pi2区间被定 位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50,该区间包含一个稻瘟病 抗性基因的基因簇（Dai 等，2010 ;Qu 等，2006 ;Wang 等，2012 ;Zhou 等，2006 ;Xiao 等，2012 ; Liu 等，2002 ;Liu 等，2011 Jiang 等，2012 ;Zhu 等，2012 ;Deng 等，2006)。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速精确选育含目标基因组DNA片段的植株的方法。
[0005] 本发明的另一目的是提供含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株的选育方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的含目标基因组DNA片段的植株选育方法，其是基 于全基因组选择育种技术，在育种过程中，通过精确的前景选择和高密度分子标记全基因 组背景选择，获得将目标基因组DNA片段导入受体植物亲本的重组植株。所述方法包括以 下步骤：
[0007] (1)以不含目标基因组DNA片段的受体植物亲本作为轮回亲本，与含有所述目标 基因组DNA片段的供体植物亲本，进行杂交、回交和自交；
[0008] (2)在育种过程中利用前景选择标记进行前景选择；
[0009] (3)在育种过程中利用高密度分子标记检测方法进行全基因组背景选择；
[0010] ⑷利用上述步骤直至获得目标基因组DNA片段两侧同源重组，目标基因组DNA片 段纯合，且背景完全回复的目标植株。
[0011] 具体地，含目标基因组DNA片段的植株选育方法包括：以不含目标基因组DNA片段 的受体植物亲本作为轮回亲本，与含有所述目标基因组DNA片段的供体植物亲本，进行杂 交和回交，获得BC^代；利用前景选择标记对BC^代进行目标基因组DNA片段单侧同源重 组片段筛选及全基因组背景选择，选择背景回复好的重组单株与受体亲本进行回交，获得 BCR代；利用正向选择标记筛选含有目标基因组DNA片段的BC2Fi代，并进行全基因组背景 选择，选择背景回复好的重组单株再次与受体亲本进行回交，获得BC^代；利用前景选择 标记对BCA代进行目标基因组DNA片段另一侧同源重组片段筛选及全基因组背景选择，选 择目标基因组DNA片段导入片段小，且背景回复好的重组单株；选中的重组单株自交一次， 获得BC 3F2代；利用正向选择标记对BC3F2代进行检测，并进行全基因组背景选择，最终获得 目标基因组DNA片段纯合，且背景完全回复的目标植株。
[0012] 前述的方法，前景选择标记包括正向选择标记和负向选择标记，其中，正向选择标 记与目标基因组DNA片段的物理距离彡50kb或遗传距离彡0. 2cM，负向选择标记与目标基 因组DNA片段的物理距离彡500kb或遗传距离彡2cM。
[0013] 本发明中涉及的植物包括但不限于饲料作物、油料种子作物、谷类作物、水果作 物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草坪作物、糖类作物、饮料作物和森林作物等 农作物植物。
[0014] 本发明还提供含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株的选育方法，包括以下步 骤：
[0015] (a)以水稻'空育13Γ为轮回亲本，含抗稻瘟病基因 DNA片段的'K22'为供体 亲本进行杂交和回交，获得BC^代；利用正向选择标记Pi2-4和负向选择标记RM19814、 RM19835对BC^代进行抗稻瘟病基因 DNA片段单侧同源重组片段筛选，并用水稻全基因组 育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
[0016] (b)选择背景回复较好的重组单株与受体亲本'空育13Γ进行回交，获得BC2Fi代， 利用正向选择标记Pi2_4对其进行检测，选择含有抗稻瘟病基因 DNA片段的重组单株，然后 用水稻全基因组育种芯片RICE6K对其进行背景选择；
[0017] (C)选择背景回复好的重组单株再次与受体亲本'空育13Γ进行回交，获得BC3Fi 代，利用正向选择标记Pi2_4和负向标记RM19814、RM19835对BCR代进行抗稻瘟病基因 DNA片段另一侧同源重组片段筛选，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景 选择，筛选到导入目标片段小，且背景回复好的重组单株；
[0018] ⑷选中的重组单株自交一次，获得BC3F2代；利用正向选择标记Pi2_4对BC 3F2代 进行检测，并利用水稻全基因组育种芯片RICE60K对其进行背景选择，最终获得目标基因 组DNA片段纯合，且背景完全回复的含抗稻瘟病基因重组DNA片段的水稻植株。
[0019] 采用上述方法获得一个抗稻瘟病基因重组DNA片段，该片段两侧的同源重组片段 的核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
[0020] 本发明还提供用于检测上述抗稻瘟病基因重组DNA片段的方法。根据该片段两侧 的同源重组片段的核苷酸序列，分别设计特异性PCR扩增引物，以待测水稻基因组为模板， 进行PCR反应，并分析PCR扩增产物。
[0021 ] 优选地，采用Sanger测序法分析PCR扩增产物。
[0022] 用于扩增及检测SEQ ID No. 1所示同源重组片段的引物组合为：
[0023] 组合 I
[0024] 扩增引物：A08X2 IF: 5，-AGCCCTGTCATTCTCGTGT-3，
[0025] A08X21R: 5 ' -AAAGGACAGGTGGAGATGG-3 '
[0026] 测序引物：A08X21F:5' -AGCCCTGTCATTCTCGTGT-3'
[0027] 组合 II
[0028] 扩增引物：A08X3 IF: 5 ' -ACAAGCCCAGTTGGAGAATC-3 '
[0029] A08X31R: 5 ' -AAGGGCATACTGGAGAAGATG-3 '
[0030] 测序引物：A08X31F:5, -ACAAGCCCAGTTGGAGAATC-3'
[0031] A08X31F2:5 ' -GCTCGATGCTACTCATATGC-3 '
[0032] 组合 III
[0033] 扩增引物：A08X22F: 5 ' -ACCCGTGGAAGCTGAAGGT-3 '
[0034] A08X22R: 5，-AAACCGATCCGAAACCACC-3 '
[0035] 测序引物：A08X22F2:5，-GCCTGTGTGTGTCAGATGAGC-3，。
[0036] 以待测样品基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，然后利用上述测 序引物对获得的扩增产物进行测序，若测序结果与SEQ ID No. 1序列一致或互补，则待测样 品中含有SEQ ID No. 1所示同源重组片段。
[0037] 用于扩增及检测SEQ ID No. 2所示同源重组片段的引物组合为：
[0038] 组合 IV
[0039] 扩增引物：A08X35F