一种两级半连续发酵生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用两级半连续发酵模式以葡萄糖或淀粉水解糖为底物发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，属于生物工程应用技术领域。
【背景技术】
[0002]2-酮基-D-葡萄糖酸是杂环化合物合成、区域选择性和立体选择性化学反应中的基础材料，目前主要用作D-异抗坏血酸及其盐类的生产原料。D-异抗坏血酸及其钠盐是一类安全、高效并具有显著性价比优势的抗氧化剂，在食品、医药、化工等工业领域已经得到了广泛应用。
[0003]文献报道的2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有酶法(如US4，351，902)、化学合成法(如US 6，018，034)和发酵法(如US 3，255，093)等3种。其中，发酵法是目前最为经济、高效和环境友好的2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法，因此在国内外工业生产中得到了普遍米用。
[0004]2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵可采用分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵和连续发酵等生产模式。分批发酵的人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期较长，生产强度及发酵液中的产物浓度均较低;补料分批发酵虽可有效提高发酵液中的产物浓度，但发酵生产强度仍然偏低;连续发酵较分批发酵和补料分批发酵的生产强度显著提高，但容易遭受杂菌的污染，设备投资较大，且发酵产物浓度较低，发酵转化率(也称糖酸转化率，即发酵生产的2-酮基-D-葡萄糖酸与发酵消耗的葡萄糖的摩尔比X 100%)也有所降低。相对于上述的三种发酵模式，半连续发酵是一种更为高效的2-酮基-D-葡萄糖酸生产模式。
[0005]半连续发酵过程中，通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基，不仅可以补充养分和底物，而且代谢有害物被稀释，起到了缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用，改善了微生物的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定，从而有利于发酵目的产物的继续合成。
[0006]已有的2-酮基-D -葡萄糖酸单级半连续发酵工艺(中国发明专利Z L200810107055.7)存在的主要问题是:①为了保证发酵产物的质量，必须使每一次放料(或补料)时发酵液中的葡萄糖浓度低于2.0g/L，但此时菌体的催化活性已经明显下降，从而使后续的发酵生产强度受到显著影响，一般不会超过6.0g.L—1.h—S②难以实现高浓度发酵，放料时发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度一般只有165.0g.L—1左右，否则会导致发酵生产强度的进一步降低。
[0007]已有的2-酮基-D-葡萄糖酸两级半连续发酵工艺(已公开的江苏大学周延政硕士毕业论文)存在的主要问题是:①在两级半连续发酵过程中，通过控制第一级半连续发酵放料时发酵液中的葡萄糖浓度(20.0g.L—工)，使菌体的催化活性得到了一定程度的提高，但仍难以达到较为理想的状态，其发酵生产强度的提高不太明显，一般不会超过7.0g.L—1.h—S②没有实现高浓度发酵，放料时发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的浓度一般只有165.0g.L—1左右。
[0008]另外，已有的半连续发酵工艺(无论是单级还是两级半连续发酵工艺)的糖酸转化率难以超过90% (通常为89%左右)。
[0009]开发高浓度、高强度、高转化率的2-酮基-D-葡萄糖酸发酵工艺是本发明的目的。
【发明内容】
[0010]本发明披露的是一种通过两级半连续发酵以淀粉水解糖(葡萄糖)为原料高浓度、高强度、高转化率地发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。本发明可以有效解决现有的2-酮基-D-葡萄糖酸半连续发酵工艺中存在的问题，在保证糖酸转化率有所提高的同时实现2-酮基-D-葡萄糖酸的高浓度高强度发酵。
[0011]本发明的总体技术方案:通过降低第一级发酵培养基中的葡萄糖浓度(不超过150.0g.L—O，提高菌体催化转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的活性，同时在其催化活性较高阶段(一级发酵过程中葡萄糖浓度降至20.0?30.0g.L—O将部分的一级发酵液转入第二级发酵罐中作为第二级发酵的种子，剩余的发酵液作为第一级发酵的种子;除淀粉水解糖中的微量氮源外，在第二级发酵培养基中不加入另外的氮源，同时提高其葡萄糖浓度，控制菌体在第二级发酵过程中的生长以减少其自身生理代谢对葡萄糖的消耗。本发明采用的转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的微生物，是保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的变形假单胞菌，分类命名为Pseudomonas plecoglossicida，保藏时间为2013年I月18日，保藏编号为CGMCC N0.7150ο
[0012]以下是本发明技术方案的具体描述:
[0013]以下操作均要按无菌操作程序进行操作。
[0014](I)在发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸的微生物，如假单胞菌(Pseudomonas)、沙雷氏菌(Serratia)、欧文氏菌(Erwinia)、节杆菌(Arthrobacter)、葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)、产喊菌(Alcaligenes)或醋酸杆菌(Acetobacter)等。该步骤培养的微生物作为两级半连续发酵的起始种子。
[0015](2)将起始种子按一定的比例接入装有一级发酵培养基的第一级发酵罐中(发酵培养基的装量为发酵罐体积的60?85% )，在一定温度下通气搅拌培养。一级发酵培养基中的葡萄糖浓度一般不超过150.0g.L—I否则会使发酵生产强度降低。
[0016](3)当一级发酵液中的葡萄糖浓度降低至20.0?30.0g.L—1时，将一定体积的一级发酵液(V，约为一级发酵液总量的50?90% )转移至第二级发酵罐中。
[0017](4)向第一级发酵罐补加一级发酵培养基至原体积(V1，约为发酵罐体积的70%左右)，向第二级发酵罐补加二级发酵培养基至规定的体积(V2，约为发酵罐体积的80%左右)，然后分别在一定温度下通气搅拌培养。除淀粉水解糖中的微量氮源外，在第二级发酵培养基中不加入另外的氮源，否则会影响发酵的糖酸转化率。
[0018](5)当二级发酵液中的葡萄糖浓度降低至2.0g.L—1以下时，将其全部从第二级发酵罐中排出以回收2-酮基-D-葡萄糖酸(盐)。
[0019](6)排空的第二级发酵罐接收第一级发酵液并被补料至规定的体积(V2)，然后在一定温度下通气搅拌培养。
[0020](7)重复(3)?(6)操作过程直至发酵出现异常迹象。
[0021]培养基中的碳源为葡萄糖(淀粉水解糖)，氮源为玉米浆、酵母膏、牛肉膏或尿素等。一级发酵培养基中的葡萄糖(以无水葡萄糖计)浓度为100?150g.L—S优选的葡萄糖浓度为140g.L—1左右;一级发酵培养基的含氮量为0.3?2.0g.L—S优选的含氮量为1.0g.L一1左右。二级发酵培养基的碳氮比(培养基中葡萄糖的质量浓度与含氮量之比)为750:1?870:1，葡萄糖浓度为260?45(^.1^(利用淀粉水解糖原液)，对应的含氮量为0.32?
0.55g.L—1O
[0022]本发明的发酵在pH4.0?7.0进行，适宜的发酵pH为5.5左右。发酵pH的控制利用中和法，中和剂为碳酸钙、氢氧化钠、氧化钙、氢氧化钙、碳酸钠、氨气或氨水等。
[0023]本发明的发酵温度为28?41°C，第一级发酵的适宜温度为30?33°C，第二级发酵的适宜温度为33?35°C。
[0024]本发明的发酵需要在有氧条件下进行，通气量大约为0.5?2.0v.V—1.min—、适宜的通气量为可保证发酵过程发酵液中的最低溶解氧浓度不低于0.5%的通气量。
[0025]本发明的发酵几乎可在常压下进行，但最好选择在0.01?0.03MPa的压力下进行，以免杂菌对发酵的污染。
【附图说明】
[0026]图1两级半连续发酵生产操作示意图
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]起始种子的培养、第一级半连续发酵和第二级半连续发酵分别采用5L、30L和50L的自控机械搅拌发酵罐，该发酵系统具有自动控温、无级调速、测定培养液溶解氧浓度和PH值等功能。
[0029]将变形假单胞菌(Ps.plecoglossicida)CGMCC N0.7150(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)接种于3.0L含有20.0g.L—1葡萄糖、10.0g.L—1玉米楽、2.0g.L—1 尿素、2.0g.IZ1KH2POhOjg.IZ1MgSO4.7H20和 2.5g.L—1 轻质 Ca ⑶ 3(灭菌前PH6.7)的种子培养基中，控制搅拌转速400r.min—\温度30°C、罐压0.02MPa、通气量0.5v.V—1.!11；[]1—1培养1411(种子液的006501?=12.4，卩!1=6.95)。
[0030]将培养的起始种子以10%左右的接种量接入21.0L含有140.0g.L—1淀粉水解糖(以葡萄糖计)、15.0g.L—1玉米浆和40.0g.L—1轻质Ca