缺失e3区复制完全型重组腺病毒4型载体系统的构建及其应用

缺失e3区复制完全型重组腺病毒4型载体系统的构建及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及基因治疗和重组疫苗领域中一种缺失E3 区复制完全型重组腺病毒4型(AdV4)载体系统的构建及其应用。 技术背景
[0002] 腺病毒5型重组系统是目前使用最广泛的腺病毒系统，自从该系统于1998年被构 建成功以来，由于腺病毒5型自身的优势以及该系统使用的方便性，已经被广泛地应用于体 外基因传导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。但是由于腺病毒5型对人体具有一定的 危害，不能被直接作为活载体疫苗使用，只能被制备成复制缺陷型(缺失E1区）疫苗，那么在 临床使用中只能产生短暂而有限的抗原表达，最终产生的抗体也相应不足。
[0003] 近些年的研究还发现，机体中针对腺病毒5型的预存免疫，大大降低了腺病毒5型 载体的应用效果，流行病学调查显示，人体感染腺病毒5型的情况十分普遍，在西方发达国 家，腺病毒5型血清阳性率约为60~70 %;而在非洲和西南亚地区，腺病毒5型血清阳性率高 达98% ;在中国，腺病毒5型血清阳性率也达到了72%，以上情况使腺病毒5型病毒载体的使 用更加受到了阻碍。
[0004] 腺病毒4型(AdV4)属于人源腺病毒E亚群中唯一的一个血清型，该病毒早在70年代 已经作为活载体疫苗被军队广泛的应用于ARD的预防，使与腺病毒相关的呼吸道疾病得到 了有效的遏制，且免疫后未见不良反应。1999年，疫苗停止供应后，新兵训练中心检测发现 呼吸道感染率明显上升。美国开始开发新的AdV4-AdV7联合疫苗，并于2011年获得Π)Α批准 启用，再次有效降低了呼吸道感染疾病的发生。因此，腺病毒4型(AdV4)可以被制备成复制 完全型疫苗，可以在机体内复制，产生持续而丰富的抗原表达，最终产生更高免疫效力的抗 体。
[0005] 另有研究表明，腺病毒4型(AdV4)同腺病毒5型病毒相比具有更高效的感染力，能 够诱导更充分的先天免疫，在机体存在针对腺病毒5型的抗体时，如果先用腺病毒4型进行 初步免疫、再用腺病毒5型加强免疫，则会产生更多针对抗原的特异性细胞因子以及T淋巴 细胞，这一结果显示，联合使用腺病毒4型和腺病毒5型载体疫苗会取得更好的效果。在中 国、阿根廷、美国、埃及等地区的流行病学调查显示，腺病毒4型在人体的感染率均较腺病毒 5型低，这意味着在机体中针对腺病毒4型的预存免疫较腺病毒5型少，这就使使用腺病毒4 型作为载体疫苗具有更多的优势。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种缺失E3区复制完全型重组腺病毒4型(AdV4AE3Genome) 载体系统及其应用。
[0007] 本发明提供的载体系统包括1个骨架质粒、1个穿梭质粒和1个包装细胞系;所述骨 架质粒含有腺病毒AdV4基因组左侧l-26569bp的片段;所述穿梭质粒含有用于插入目的基 因的克隆位点以及腺病毒AdV4基因组右侧反向重复序列;所述腺病毒AdV4基因组具有缺失 基因，缺失基因为E3区基因；所述的包装细胞系为HEK-293细胞系(ATCC，CRL-1573tm)。
[0008] 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统，所述的骨架质粒为 pAd4FAST，所述的骨架质粒pAd4FAST依次含有pBR322质粒的复制起点、氨苄青霉素的抗性 基因和AdV4基因组1 -26569bp。
[0009] 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统，所述的穿梭质粒为 pAd4FAST-Shuttle，所述的穿梭质粒依次含有PBR322质粒的复制起点、卡那霉素的抗性基 因、AdV4基因组右侧反向重复序列、用于与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右臂和左臂 (Rarm、Larm)〇
[0010] 所述的缺失E3区的复制完全型重组腺病毒AdV4载体系统，所述的骨架质粒 pAd4FAST中，AdV4基因组左侧末端添加限制性内切酶PacI位点，右侧末端添加限制性内切 酶Spel位点。
[0011] 所述的缺失E 3区的复制完全型重组腺病毒A d V 4载体系统，所述的穿梭质粒 pAd4FAST-Shuttle中，在能够与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右臂和左臂（Rarm、 Larm)序列之间含有一个限制性内切酶Swal的识别位点ATTTAAAT，并在AdV4基因右侧反向 重复序列右侧末端添加一个限制性内切酶Pac 1的识别位点TTAATTAA。
[0012] 所述的载体系统用于制备重组腺病毒的用途。
[0013] 利用本载体系统能够制备携带目的基因的重组AdV4腺病毒。将目的基因克隆到穿 梭质粒pAd4FAST-Shu111 e的克隆位点处，将携带目的基因的穿梭质粒经限制性内切酶SwaI 酶切线性化后转化入含有骨架质粒pAd4FAST的大肠杆菌BJ5183菌株（美国Stratagene公 司）中，在大肠杆菌BJ5183细胞内线性化的穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle与骨架质粒 pAd4FAST经过同源重组得到携带目的基因的腺病毒质粒。该质粒经限制性内切酶Pac頂每 切，释放重组腺病毒基因组，利用DNA转染方法将重组腺病毒基因组转染包装细胞系HEK-293,在包装细胞系内拯救得到携带目的基因的重组AdV4腺病毒。起始得到的少量腺病毒可 以进一步用包装细胞扩增，制备大量的重组病毒。
[0014] 在制备的重组腺病毒中，除基因组含有部分外源序列（目的基因表达框)外，基因 组其他部分以及病毒所有结构蛋白均源于人源腺病毒4型疫苗株（GenBank登录号： AY594254)。
[0015]由于人源腺病毒AdV4基因组安全可靠，因此在其可以感染的宿主中有望被用作基 因治疗以及重组疫苗使用。
【附图说明】
[0016] 图1为骨架质粒pAd4FAST的酶切鉴定图；图中，1表示λ-EcoTH I digest DNA Mar ker; 2表不Pac I和Sp e I酶切后的pAd4FAST质粒;3表不pAd4FAST质粒；
[0017] 图2为骨架质粒pAd4FAST的测序鉴定图；图中，PacI site中横线显示克隆标记位 点PacI; Spel site中横线显示克隆标记位点Spel ;AseI site中横线显示克隆标记位点 Asel ；
[0018] 图3为骨架质粒pAd4FAST的构建示意图；
[0019] 图4为载体pShuttle-Ι的酶切鉴定图；图中，1表示DL15000 DNA Marker;2表示 pShuttle-1载体；3-5依次表示经过PacI、SwaI和Spel酶切后的pShuttle-1载体；6表示 250bp ladder DNA Marker；
[0020] 图5为穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle的构建示意图；
[0021] 图6为穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle的酶切鉴定图；图中，1表示DL15000 DNA Marker;2表不pAd4FAST_Shuttle载体；3-5表不依次为PacI、SwaI和Spel酶切后的 pAd4FAST_Shutt 1 e载体；
[0022] 图7为携带目的基因的质粒pAd4FAST-Shuttle-EGFP的酶切鉴定图；图中，1表示 DL15000 DNA 1^1迚61;2表示？4(14?451'-51111忖1646??载体；3表示5￥31和5?61酶切后的 pAd4FAST-Shuttle-EGFP(EGFP 逆时针克隆）载体；4 表示 Swal 和 Spe 頂每切后的口4(14?451'-Shuttle-EGFP(EGFP顺时针克隆）载体；
[0023] 图8为重组质粒pAd4FAST-EGFP的酶切鉴定图；
[0024] 图9为骨架质粒pAd4FAST与携带目的基因的穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle-EGFP在 大肠杆菌BJ5183中重组的示意图；
[0025]图10为拯救的P3代AdV4-EGFP病毒引起的致细胞病变效应(CPE)及荧光表达情况； 图中，a对应的横排图表示P3代AdV4-EGFP病毒感染HEK-293细胞后不同时间的病变情况;b 对应的横排图表不不同时间焚光蛋白的表达情况；
[0026] 图11为拯救的AdV4-EGFP病毒（)与亲本病毒AdV4AE3(.)的生长曲线图。
【具体实施方式】
[0027]在本发明的一个实施方案中，本发明的骨架质粒含有腺病毒AdV4基因组左侧1-26569bp的片段。
[0028]在具体实施方案中，所述的骨架质粒为pAd4FAST，含有pBR322质粒的复制起点、氨 苄青霉素的抗性基因和AdV4腺病毒基因组左侧l-26569bp的片段。
[0029]在具体实施方案中，所述骨架质粒pAd4FAST在AdV4基因组左侧末端添加限制性内 切酶PacI位点，右侧末端添加 Spel位点。
[0030]在本发明的一个实施方案中，本发明的穿梭质粒为pAd4FAST-Shuttle，依次含有 PBR322质粒的复制起点（Ori)、卡那霉素的抗性基因（Kan)、AdV4基因组右侧反向重复序列 (ITR)、用于与骨架质粒pAd4FAST发生同源重组的右臂和左臂(R arm、L arm)(L arm在AdV4 (GenBank登录号:AY594254)基因组上的片段位置：Int-1000nt，R arm在AdV4(GenBank登录 号:AY594254)基因组上的片段位置：25833nt-27476nt)。
[0031]在本发明的具体实施方案中，所述穿梭质粒pAd4FAST-Shuttle在能够与骨架质粒 pAd4FAST发生同源重组的左臂和右臂之间含有一个限制性内切酶Swal的识别位点 (ATTTAAAT)，在所述AdV4基因组右侧反向重复序列右侧末端添加有一个限制性内切酶PacI 的识别位点(TTAATTAA)。
[0032] 下面通过实施例对本发明进行更加详细的说明，但本发明的内容并不限于以下具 体实施例。
[0033] 实施例1
[0034] 1.骨架质粒pAd4FAST的构建及电转化感受态细胞的制备
[0035] (1)骨架质粒pAd4FAST的构建：
[0036] ①以pAdeasy-1载体（美国stratag