一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种建鲤ty3-gypsy反转录转座子JRE及其用途。
【背景技术】
[0002]DNA转座子(transposon )是一类能在真核生物染色体上不断移动位置的功能性DNA片段，对发现新基因和分析基因功能具有重要的作用，被认为是导致真核生物遗传变异的主要原因之一。转座子作为插入突变原或分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆，一些甚至可作为转化载体用于转基因动植物的制备。piggyBac转座子在果绳(Bactrocera tryoni，)[4]、家蚕(Bombyx mori)等昆虫中，能作为一个高效、稳健的载体进行转基因研究，并促进生殖种系转化。家禽上也有报道利用mariner转座元件可实现转基因鸡的制备。而在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中发现的Tc3转座元件则已经成功转化斑马鱼(Dan1 rer1)。根据转座方式的不同，转座子可分为DNA转座子和反转录转座子(retrotransposon)。其中，反转录转座子是指以RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件，亦被称为返座元(retroposon)。近几年的研究表明返座元是真核生物中最重要的一类转座元元件，也是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。按照序列结构中是否含有长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)又可分为LTR反转录转座子和无LTR反转录转座子。
[0003]LTR反转录转座子主要由2个开放阅读框(open reading frames, ORFs)构成，即核心蛋白基因(gag)和酶基因区域(polhgag蛋白编码类似于RNA病毒颗粒反转录相关的蛋白，Pol基因编码逆转录过程中的主要蛋白，包括蛋白酶(PR)、反转录酶(RT)、RNase H和整合酶(INT) AT和RNase H是反转子复制、转座的关键酶，INT主要作用是使反转录转座子插入到染色体中的新位点。由于pol基因同源性及INT蛋白的排列位置，LTR反转录转座子又分为ty3_gypsy和tyl-copia两大类。LTR逆转录转座子采用的是“拷贝-复制”的机制，在宿主基因中不断扩增；由于返座元带有增强子、启动子等调控元件，最终会参与到宿主基因的表达及新基因的产生等过程。目前在多种水生生物基因组中已经鉴定出一些LTR反转录转座子，如斑马鱼、金鱼(Carassius auratus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)等，但在建鲤中并没有LTR转座子的报道。反转录转座子的这种插入导致产生变导的功能在鱼类重要性状相关基因的筛选、重要基因的功能研究以及转基因动物等方面有着重要的研究和运用前景。例如，Tol2转座系统已经用于多种动物的转基因研究，成功获得突变体，如果绳(Drosophila melanogaster)、斑马鱼、非洲爪蟾(Xenopus laevis) J^Gallusgallus)、小鼠(Mus musculus)等模式生物。
[0004]反转录转座子作为一种新型高效的转基因工具，正在被广泛地研究与应用于转基因育种、生物反应器、害虫防治、基因功能研究等方面，具有广阔的前景。例如，通过转座子在体外构建编码人们期望的有疾病抗性或改变生物体生长速度基因的载体质粒，将其导入受精卵，使之在染色体上正确整合，在组织细胞中适当表达，培养出具有期望性状表型的转基因新品系，从而在较短时期内培育出常规方法不能或需要长期培育才能育成的品种;借助一个高效的转座载体，将外源基因导入生物内，使其稳定表达并遗传，有助于人们对目的生物进行更加深入的研究，为体细胞遗传学的研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新系统，进而能改良经济生物的生产性能。而现今面临着转基因的稳定性、安全性等问题，只有通过今后进一步深入研究转座子系统及转座机制和宿主因子对其转化效率的影响，才能更好地推广转基因技术的发展。转座子技术作为基因功能分子的重要工具，特别是对于功能基因组学研究来说，不仅要确定序列的编码区和非编码区，还要鉴定其相关的生物功能。总之，发现更多的转座子及探明其结构机理，对于基因功能研究、育种等具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种建鲤反转录转座子，其核苷酸序列含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0007]一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0008]一种基因载体，所述的基因载体包含:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0009]作为本发明的一种实施方式，所述的基因载体是以建鲤反转录转座子为基本载体，作为本发明的另一种实施方式，所述的基因载体是以建鲤反转录转座子JRE为基本载体，在JRE 1237位点处插入SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0010]—种基因转移系统，包含:
a)所述的核苷酸序列SEQNo 1，
b)所述的核苷酸序列SEQNo 2。
[0011]所述的建鲤反转录转座子JRE在介导DNA导入细胞中的应用。
[0012]所述的基因载体以及基因转移系统在介导DNA导入细胞中的应用。
[0013]在研究中发现建锂基因组中存在一个ty3-gypsy反转录转座子类型的转座子，将其命名为JRE转座子，所述建鲤反转录转座子JRE具有LTR反转录转座子的经典结构(图1)，包含gag蛋白和pol蛋白结构域的编码序列。其中pol结构域的基因顺序为PR-RT-RH-1N，因而该转座子属于ty3-gypsy类型。JRE—共由5126 bp核苷酸构成，包括470 bp 5端LTR，4203 bp ORF和453 bp 3端LTR。整个ORF编码1401个氨基酸，5端LTR和3端LTR具有两个倒转重复的边界序列TG...CA。JRE转座子两边是以ATCTT为边界的正向重复。LTR具有以TGT开始、以ACA结束的典型反向重复序列区，在LTR中也发现了多嘌呤位点，如位于203bp处的AAAGGAGGTAA[25]，在5端LRT中具有与ser_tRNA 3’端互补的PBS序列。
[0014]有益效果:本发明优点在于:
1、分离得到具有完整左右长末端重复序列的转座子JRE，以及以此转座子构建的转座系统，并且在建鲤肝细胞中进行了转座活性验证。
[0015]2、本发明中所涉及到的转座子来源于建鲤本身，因此在建鲤转基因研究中具有更好的同源性，具有较高的转座效率。
【附图说明】
[0016]图1、JRE转座子结构图开放阅读框以长方形表示；2个三角形表示反向重复序列(TG...CA); gag，核心蛋白；pol，酶基因相关蛋白；PR，蛋白酶；RT，反转录酶；RH，RNA酶；IN，整合酶；PBS，PPT分别表示引物结合位置和多聚嘌呤位置.图2 JRE转座子分子系统树构建；
图3 JRE转座子转基因载体图谱。
【具体实施方式】
[0017]下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0018]实施例1、建鲤ty3-gypsy反转录转座子JRE的获取和分析 1.1实验鱼
建鲤为本实验室保存，采集血液进行基因组DNA提取。
[0019]1.2基因组DNA提取
采用大连宝生物工程有限公司Whole Blood Genomic DNA Extract1n Kit提取建鲤基因组DNA，主要步骤如下:取建鲤5尾，尾静脉无菌采血，采集的血液10 HL使用含蛋白酶K和RNase A裂解液56°C消化15 min,然后加入200 pL 100%乙醇，进行过柱纯化，最后使用elut1n buffer洗脱与膜结合的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳进行检验。用蒸馏水将DNA样品稀释备用，其他样品保存到-70°C备用。
[0020]1.3 PCR扩增与检测
根据前期研究中建鲤基因组部分测序结果及Ty3-gypsy转座子的保守区的相关文献设计引物序列5 ’ GATACATCGCCCATCCCTACG3 ’，5 ’ GATACATCGCCCATCCCTACG3 ’，以上述所获建鲤DNA 为模板，进行PCR 扩增，PCR 扩增混合物中含 10mmol/L Tris-HClCpH 8.4)、20mmol/LKCU10mmol/L (NH4)2S04、I.5mmol/L MgC12、0.lmmol/L 每种dNTPs、引物浓度为0.2ymol/L，约200ng。基因组DNA、2U Taq酶，反应总体积为SOyLt3PCR扩增程序为:94°C预变性5min后；98°C 10s,68°C 15min，共30个循环；最后再72°C延伸lOmin。取3yL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在B1-Rad凝胶成像系统中照相记录。获得的基因片段的PCR产物经电泳分离、割胶回收、PCR产