一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产减毒类脂A的Cronobacter sakazakii突变株及其应用，属于基 因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种自然界中广泛存在的食源性 革兰氏阴性致病菌，主要污染婴儿配方奶粉。它可以引起新生儿脑膜炎、败血病、菌血症及 坏死性小肠结膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革兰氏阴性菌的致病能力与其外膜类 脂A的分子结构密切相关，但关于阪崎克罗诺肠杆菌类脂A分子修饰及作用还有待研究。
[0003] 细菌细胞膜表面的LPS并不是一个稳定的结构，细菌处于特定条件下是会对其结 构进行不同的修饰，这些修饰赋予了细菌对抗菌剂的抗性，以及提升了入侵宿主的能力。 PmrA-PmrB是一个二元调控系统，调控多种发生在LPS上的化学修饰，并且它可以在多种细 菌物种内行使作用。PmrA-PmrB的修饰作用可以增强细菌对阳离子抗菌肽粘菌素的抗性以 及细菌在巨噬细胞中的复制能力。同时，PmrA-PmrB二元调控系统还对细胞的生命活动有着 整体的影响，可以影响细菌的毒性。
[0004] 疫苗佐剂(Vaccine adjuvant)，又称免疫增强剂（Immunomodulator)，是在疫苗接 种过程中辅助疫苗作用、改善或增强疫苗作用效果的一类物质。免疫佐剂需具备有效激起 非特异性免疫反应，增强机体对某疫苗的免疫原性或保护性应答的能力。
[0005] 如何降低菌株毒性以便制备疫苗佐剂是目前亟需解决的问题之一。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供C. sakazakii的类脂A分子中修饰相关的基因工 程菌，检测该修饰对菌株的影响。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种Cronobacter sakazakii的基因工程菌，所述基 因工程菌缺失了 ESA-03574基因片段。
[0008] 在本发明的一种实施方式，所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID N0:1 的序列。
[0009] 在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌为无抗性C.sakazakii BAA894AESA-03574,以Cronobacter sakazakii BAA894为出发菌、缺失了核苷酸序列为SEQ ID NO: 1 的 ESA-03574基因片段。
[0010] 在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的ESA-03574 敲除片段电转化入含 pKD46 质粒的 C. sakazakii BAA894,获得突变株 C. sakazakii BAA894 Δ ESA-0 3574-1 oxPkan，再化转入 pKD-Cre 质粒（参考文献：Yaning Han, Construction of Monophosphoryl Lipid A Producing Escherichia coli Mutants and Comparison of Immuno-Stimulatory Activities ofTheir Lipopolysaccharides , Marine Drugs，2013，11，363-376)，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD- Cre质粒后获得无抗性lipidA的基因结构突变的基因工程菌。
[0011]在本发明的一种实施方式，所述ESA-03574敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:2 所示。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种降低Cronobacter sakazakii对阳离子抗菌肽抗 性和/或降低Cronobacter sakazakii对HEK4细胞刺激作用的方法，所述方法是敲除 Cronobacter sakazakii菌的ESA-03574基因片段。
[0013] 在本发明的一种实施方式，所述Cronobacter sakazakii菌株为BAA894;所述ESA-03574 基因片段的核苷酸序列是 SEQ ID NO: 1 的序列。
[0014] 在本发明的一种实施方式，敲除了ESA-03574基因片段的Cronobacter sakazakii 菌在低pH(比如pH 5)条件下作用。
[0015] 在本发明的一种实施方式，所述降低Cronobacter sakazakii对HEK4(即HEK-Blue hTLR4)细胞刺激作用，检测方法如下：
[0016] HEK-Blue hTLR4细胞为弱贴壁细胞，细胞培养体系：DMEM高糖培养基+10%FBS+ 100U/mL-100yg/mL Pen-Strep双抗+100yg/mL Normocin多效抗生素，于37°C，5%C02条件 下培养，并隔代添加 lXHEK-Blue筛选液进行筛选。细菌菌体收集后用无热源磷酸缓冲液 (PBS)洗两次，再用PBS梯度稀释加入96孔板，每孔0.02mL，无菌PBS作为对照；HEK-Blue hTLR4细胞收集计数后用HEK-Blue?检测液重悬，将0.18mL细胞悬液接种到96孔板，每孔1.4 X 105个细胞，C · sakazaki i BAA894和C · sakazaki i BAA894 Δ ESA-03574细菌和HEK-Blue hTLR4细胞混合培养12h检测0D63QnJ^吸光度，吸光度读数值与TLR4信号通路激起的强度成 正比。
[0017] 本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌在阳离子抗性肽及疫苗佐剂方面应 用。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 本发明通过将Cronobacter sakazakii菌株的ESA-03574基因片段进行敲除，使 Cronobacter sakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性降低了32倍、更容易被抗菌肽杀死， Cronobacter sakazakii突变株细胞在低pH下激活TLR4免疫通路的能力减弱，对TLR4的刺 激能力减弱，对细胞毒性减弱，对后期免疫反应产生细胞因子开发疫苗佐剂有一定的帮助， 有利于疫苗佐剂的开发。
【附图说明】
[0020] 图 1 pH 7 ·0和pH 5 ·0条件下Cronobacter sakazakii BAA894 Δ ESA-03574的类脂 A的ESI/MS分析；
[0021 ] 图2 pH 5.0条件下ESA-03574对ESA-02008基因转录的调控；
[0022] 图3 BAA894野生型和突变株的外膜渗透性；
[0023] 图4 C. sakazaki i BAA-894和C. sakazaki i ΒΑΑ-894Δ ESA-03574突变菌株对TLR4 信号通路的激活能力。
【具体实施方式】
[0024] 类脂A的的结构鉴定与分析：
[0025] ESI/MS分析:类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:l，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小 于m/z 2500。
[0026] 实施例 1 突变株C.sakazakii BAA894AESA-03574的构建
[0027] UESA-03574基因敲除片段的获得
[0028]采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得ESA-03574基因敲除片段，其两端分别 为ESA-03574基因上下游同源臂、中间为带有LoxP位点的kan片段。ESA-03574基因敲除片段 的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。将ESA-02008和ESA-03574基因敲除片段分别克隆到 pBlueScript II SK( + )，获得重组质粒pBlueScript II SK( + )-ESA-03574U-Lkan-ESA-03574D。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段ESA-03574U-Lkan-ESA-03574D。
[0029] 2、敲除感受态的制备及电转化
[0030] 接种带有Red重组辅助质粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products . ProcNatlAcadSci USA ,2000 ,97(12) :6640-6645)的 CronobactersakazakiiBAA894于含 100yg/mL氨节青霉素的LB液体培养基中，30°C，200rpm 过夜培养。按2 %接种量转接lOOmL LB液体培养基，30 °C，200rpm培养至0D6q() = 0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmo 1 /L)诱导重组酶的表达，继续培养0D6QQ = 0.5，将培养液冰浴半小 时后转入预冷的5〇1111^离心管中，4<€，4000印1]1离心1〇111；[11收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油 洗涤3次，最后用lmL 10 %甘油悬浮，每管80yL分装至预冷的无菌EP管中。
[0031 ] 将500-1000ng ESA-03574敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电 击5ms，30 °C孵育2h，涂布30yg/mL卡那霉素的LB固体平板，30 °C培养，挑取转化子于含30yg/ mL卡那霉素及100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。
[0032] 3、突变株抗性标记的去除
[0033]将PCR验证阳性的菌株接种含30yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42°C过夜培 养，将培养液划线SOyg/mL卡那霉素的LB固体平板，37 °C培养，挑取单菌落验证其对氨苄青 霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为和 C. sakazaki iBAA894AESA_03574: : kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pKD-Cre质 粒，42 °C热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加 入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导LoxP位点特异性重组，PCR 验证挑选转化子。将PCR